道1: IPTG誘導前；
[0061] 泳道2:0.3mmol/L IPTG 37°C誘導4h;
[0062] 泳道3-4:高速離心后上清；
[0063] 泳道5-6:高速離心后沉淀。
[0064]圖4顯示了SDS-PAGE檢測親和層析純化的多價EZH2腫瘤相關抗原肽的結果；
[0065]泳道1:親和層析純化的多價EZH2腫瘤相關抗原肽；
[0066] 泳道2:0.3mmol/L IPTG 37°C誘導4h的菌液；
[0067] 泳道3:未加誘導劑IPTG的菌液；
[0068] 泳道 Μ:標準蛋白 marker-431。
[0069]圖5顯示了Western Blot鑒定原核表達的多價EZH2腫瘤相關抗原肽；
[0070]用抗6 X his標簽單抗作為一抗：
[0071]泳道1-2:純化后的多價EZH2腫瘤相關抗原肽；
[0072] 泳道3: IPTG 37 °C誘導4h的菌液；
[0073]用抗EZH2多抗作為一抗：
[0074]泳道1:純化后的多價EZH2腫瘤相關抗原肽；
[0075]泳道2:0.3mmol/L IPTG 37°C誘導4h的菌液。
[0076] 圖6顯示了 ELISA法檢測抗血清效價的結果。
【具體實施方式】
[0077] 現參照下列意在舉例說明本發明（而非限定本發明）的實施例來描述本發明。
[0078] 除非特別指明，本發明中所使用的分子生物學實驗方法和免疫檢測法，基本上參 照J.Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989,以及 F. M. Ausube 1等人，精編分子生物學實驗指南，第3版，John Wi ley&Sons，Inc.，1995中所述 的方法進行；限制性內切酶的使用依照產品制造商推薦的條件。實施例中未注明來源的試 劑均是本領域的常規試劑或市售可得的試劑。本領域技術人員知曉，實施例以舉例方式描 述本發明，且不意欲限制本發明所要求保護的范圍。
[0079]材料與試劑
[0080]日本大耳白兔從湖北荊州動物中心購買。菌株E.coli BL21(DE3)、質粒pET30a( + ) 由本實驗室保藏，限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、預染蛋白標準品購自Fermentas公司， dNTP和PCR試劑盒為TaKaRa公司產品，DNA回收純化試劑盒為Omega公司產品，抗Hi s抗體和 抗EZH2抗體為Prote intech公司產品，羊抗兔IgG-HRP由北京中杉金橋公司提供，ECL顯色液 為Thermo Scientific公司產品，弗式不完全佐劑和弗式完全佐劑為Sigma-aldrich公式產 品。DNA合成和測序由上海生工生物工程有限公司完成。
[0081 ]實施例 1 質粒 pET30a( + )-EZH2-antigen 的構建
[0082] 選擇4條EZH2中的腫瘤相關抗原肽段作為研究對象（Peptide-l:Aal20-128， Peptide-2 :Aal65-174，Peptide-3:Aa291-299，Peptide-4:Aa735-742)，將它們的編碼序列 進行融合以獲得一種能同時編碼這4條腫瘤抗原肽的人工短DNA序列（108bp)，依據這些肽 段的編碼序列設計合成如下兩條DNA單鏈：
[0083] 1)5'-GGAAGATCTGTTTATGGTGGAAGATGAAACTGTTTTATTTATAAATGATGAAATTTTTGTGGAG TTGAAATATG，
[0084] 2)5'-CCGCTCGAGTCAGACATACTTCAGGGCATCAGCCTGCTTACGATGTAGGAAGCAGTCATATTTC AACTCCACAAAA〇
[0085] 上述兩條單鏈的3'末端之間有20個堿基互補，5'末端分別含有Bglll和Xhol酶切 序列(有下劃線部分）。將上述兩條DNA單鏈等量混合后，用重疊延伸PCR技術獲得全長130bp 的雙鏈DNA片段(見圖1A)，該片段除含為多價EZH2腫瘤相關抗原肽編碼的序列（108bp，SEQ ID NO.9)外，兩側還分別引入限制性酶切位點和保護堿基以利于克隆操作。PCR條件為94°C 變性5min;94°C變性lmin、45°C退火5min、72°C延伸30s為一個PCR循環，反應進行12個循環； 最后72°C延伸5min。
[0086] 純化重疊延伸PCR獲得的產物并用Bglll和Xhol雙酶切消化后克隆入經相同酶消 化的原核表達質粒pET30a( + )中，由此獲得重組質粒pET30a( + )-EZH2-antigen經擴大培養 后，用酶切和DNA測序鑒定，確證pET30a( + )-EZH2-antigen中插入的DNA序列正確無誤和插 入方向正確(結果見圖1B、1C、1D)。
[0087] 實施例2多價EZH2腫瘤相關抗原肽的原核表達與純化
[0088] 用質粒pET30a( + )-EZH2-antigen轉化BL21(DE3)感受態細胞，經0.1g/L卡那霉素 瓊脂平板37 °C過夜篩選后，挑取單克隆菌落接種于LB培養基中，37 °C震蕩培養過夜。取小量 過夜培養菌液，加入40倍體積的LB培養基，37 °C培養3h，在宿主菌生長達對數期時，加入 IPTG(終濃度0.3mmol/L)誘導宿主菌表達目的蛋白，繼續37°C培養4h后，離心收集細菌，然 后用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達。如圖2所示，IPTG誘導后細菌內出現大量多價EZH2腫瘤 抗原肽重組蛋白，表觀分子量與預測分子量一致。
[0089]將收集的細菌重懸于PBS中（NaCl 137mmol/L，KH2P〇42mmol/L，Na2HP〇4lOmmol/L， KC1 2.7mmol/L)，4°C超聲波破碎，離心后分別收集上清和沉淀，然后用SDS-PAGE電泳技術 分析誘導表達的基因重組蛋白的溶解度。結果發現，多價EZH2腫瘤相關抗原肽主要存在于 超聲沉淀中，即目的蛋白在該誘導條件下主要以包涵體形式存在(結果見圖3)。在該實驗條 件下多價EAH2腫瘤相關抗原肽在細菌內合成速度過快和合成量過大可能是這種現象發生 的原因。
[0090]由于在大腸桿菌中由pET30a( + )-EZH2-antigen指導合成的基因重組蛋白的5'端 含有6 XHis標簽，本實驗采用Ni-NTA樹脂在變性條件下(8M尿素)對重組蛋白進行親和層析 純化。主要步驟為:經pET30a( + )-EZH2-antigen轉染的大腸桿菌經IPTG誘導表達4h后離心 收集菌體，Buffer B(8mol/L尿素，100mmol/L Na2HP〇4,10mmol/L Tris，pH8.0)重懸細菌，在 37°C震搖2h裂解細胞，細胞裂解液上Ni-NTA層析柱后，Wash Buffer(8mol/L尿素，lOOmmol/ L Na2HP〇4，10mmol/L Tris，pH 6.3)洗脫雜蛋白；然后用Buffer E(8mol/L尿素，100mmol/L 他2即〇4，1〇111111〇1/11^8，？!14.3)洗脫結合在附-階4樹脂上的基因重組蛋白。上述純化的蛋 白樣品中包含的尿素經透析逐步去除。用于透析的緩沖液為含尿素梯度濃度的磷酸鹽緩沖 液（10mmol/L Na2HP〇4，10mmol/L NaH2P〇4,5 %甘油，pH7 · 4，尿素濃度梯度為5 · 0mol/L、 2.5mol/L、l .0mol/L、0.0mol/L)，每種尿素濃度下于4°C透析12h。透析后的蛋白樣品經SDS-PAGE鑒定后保存于-80 °C備用。鑒定結果顯示，該方法能獲得純度約95 %的多價EZH2腫瘤相 關抗原肽重組蛋白（見圖4)。
[0091] 實施例3Western Blot分析多價EZH2腫瘤相關抗原肽
[0092]用純化的多價EZH2腫瘤相關抗原肽經15%的SDS-PAGE分離后，電轉移至PVDF膜 上。膜用5 % 脫脂牛奶_TBST( 20mmol/L Tri s-HCl，150mmol/L NaCl，0 · 05 % Tween-20，pH 7.4)室溫封閉1小時后，先后與第一抗體(抗EZH2抗體或抗Hi s標簽抗體)和HRP標記的第二 抗體作用，ECL法示蹤目標蛋白。結果證實，該重組蛋白能被抗EZH2抗體和抗His標簽抗體有 效識別和結合，該結果說明，人工制備的多價EZH2腫瘤相關抗原肽具有EZH2特異性抗原特 征(見圖5)。
[0093]實施例4抗多價EZH2腫瘤相關抗原肽抗體的制備
[0094]用純化的多價EZH2腫瘤相關抗原肽免疫日本大耳白兔以制備相應的多克隆抗體。 首次免疫時用500yg抗原蛋白與等體積的弗式完全佐劑混合，冰浴超聲乳化后，多點皮下注 射。2周后進行二次加強免疫，每次用lOOyg抗原蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混合，冰浴超 聲乳化后，多點皮下注射，間隔時間2周。最后一次加強免疫1周后，耳源靜脈取血，制備血 清。
[0095]實施例5ELISA法檢測血清抗體效價
[0096]純化的多價EZH2腫瘤相