關抗原肽用包被緩沖液稀釋至終濃度為10mg/L，用此溶液 包被96孔酶標板，每孔10(^1。4°(：包被16h后，加入序列稀釋的抗體（即實施例4制備的兔抗 血清)溶液37°C孵育30min，每孔100μΙ，再加入1:5000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG(100yl/ 孔），37 °C孵育lh后，用TMB法顯色。實驗中以未免疫小鼠血清為陰性對照、PBS為空白對照， 酶標儀測量每孔0D450值。以空白對照調零，待測孔0D450值與陰性對照孔0D450值的比值2 2.1即判定為陽性，以能獲得陽性的最大稀釋度作為抗體的效價。結果顯示，人工制備的多 價EZH2腫瘤相關抗原肽能在動物體內高效誘導抗體生成，抗血清效價為1:64萬(見圖6)。 [0097]盡管本發明的【具體實施方式】已經得到詳細的描述，但本領域技術人員將理解:根 據已經公開的所有教導，可以對細節進行各種修改和變動，并且這些改變均在本發明的保 護范圍之內。本發明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
[0098] SEQUENCE LISTING α?〇ν 申請人 <120> -種多價t2H2腫瘤相關抗原肽及其制備 <130>案卷號 <160> 1,2 <.170> Pa tent. In version .3、5 <210> 1. <211〉 9 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223> EZH2腫瘤相關抗原肽段Aal20-128 〈側> 1. .Plie Met V.al Gin .Asp. Gin Thr Val Leu 1 5 <.2.1〇> 2 <2.11> 27 <212> DM <213〉人工序列 <220> <223〉EZ把腫瘤相關抗原肽段Aal:20-128的編碼核苷酸序列 <400> 2 tttagtgtgg aagatgaaac igtttta 27
[0099] <210> ：3 <211> 10： <212〉PR:T <213> 人工序列 <220> <2Μ> ΕΖ?2,腫瘤相_抗原.膚段 Aal:6.5-、1_74 <400> 3 Pbe lie- Asn Asp G:lu. Tie Phe Val G'lti .Leu 1 5： 10. <.2.1〇> 4 <211〉 30 <212> DNA <2.13> 人工序列 ，220、 <223〉EZH2腫瘤相關抗原肽段Aal65-174的編碼核苷酸序列 〈側> 4 tttaiaaatg atgaaatttt igtggagttg 30 <210> 5 <211〉 9 <212> PRT <213> 人工序列 ，220> <223〉EZH2腫瘤相關抗原肽段Aa291-299
[0100] <400> 5 Lys Tyr Asp Cys P'h.e Leii His· Arg- Lys. 1 :5: <.210:> B <211> 27 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉EZ.H2:腫瘤相關抗原肽段Aa2_91-2顯的編碼核苷酸序列 <400> 6 aa.atatgact gcttcctaca； tcgtaag .27 <210〉 7 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列 <220> <223〉EZH2腫瘤相關抗原肽段Aa735-742 <400> T Gin Ala Asp Ala Leu Lys Tyr V.al 1 :5:
[0101] <210> 8' <211〉. 24 <212〉.麻 <213〉人工序列 <220> <223〉. EZ.H2腫瘤相關抗原肽段Aa7&5-742:飾編礙核苷爾序列 <400> 8 caggctgatg .ccctgaagta tgtc 2'4- <210> 9 <211〉. 3.β. <212> PRT <213/ 人工序列 <.22：0> <223〉多價EZH2腫瘤相關抗原肽 <4：00> 9 Phe Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu P:he. lie· Asn Asp G.lu lie Phe 1 5 10 15 Val Glu Leu Lys Tyr Asp Cys Phe Leu His Arg Lys Gin Ala Asp Ala 20 25 30 Leu Lys Tyr ￥al 35 <.21：0> 10 <211> 108 <212> DNA <213:> 人工序列
[0102] <.22:0:>' <223>多價EZH2腫瘤相關抗原肽的編碼核苷酸序列 <400> 10 tttagtgtgg aagatgaaac Tgttttattt ataaatgatg aaatrrttgt ggagttgaaa 60 tatgactgct tcctacatcg taagcaggct gatgccctga agtatgtc 108 C210> 1.1. <211> 74 <212> DM. <213〉Λ工序列 <220〉 <.22:3>合成的單鏈 <400> 11 ggaagatctg tttatggtgg aagatgaaac tgttttattt ataaatgatg aaatttttgt 60 gg-.a;gttgaaa tatg 74 <210〉 12 <211〉 76： <212> DMA <213〉 人工序列 <.22:0:>' <223〉 合成的DNA單鏈 <400> 12 ccgctcgagt cagacatact tcagggcatc agcctgctta cgatgtagga agcagtcata 60 tttcaactcc acaaaa： 76.
【主權項】
1. 一種多價EZH2腫瘤相關抗原肽，其由SEQIDN0.1、SEQIDN0.3、SEQIDN0.5和 SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，以及任選的標簽、任選的接頭和任選的信號肽組成;優選 地，所述多價EZH2腫瘤相關抗原肽由如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列及標簽組成；優選 地，所述多價EZH2腫瘤相關抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示;優選地，所述標簽為6 X His標簽。2. 編碼權利要求1的多價EZH2腫瘤相關抗原肽的多核苷酸。3. 包含權利要求2的多核苷酸的構建體。4. 包含權利要求2的多核苷酸或權利要求3的構建體的載體，例如所述載體是表達載 體；優選地，所述表達載體為包含權利要求2的多核苷酸或權利要求3的構建體的質粒 pET30a(+)。5. 包含權利要求2的多核苷酸或權利要求3的構建體或權利要求4的載體的宿主細胞； 優選地，所述宿主細胞為原核細胞;優選地，所述宿主細胞為大腸桿菌。6. -種藥物組合物或疫苗，其包含權利要求1的多價EZH2腫瘤相關抗原肽，任選地還包 含藥學可接受的載體和/或賦形劑。7. 權利要求1的多價EZH2腫瘤相關抗原肽用于制備藥物組合物的用途，所述藥物組合 物用于預防和/或治療腫瘤。8. 權利要求1的多價EZH2腫瘤相關抗原肽用于制備抗體的用途;優選地，所述抗體用于 預防和/或治療腫瘤。9. 制備多價EZH2腫瘤相關抗原肽的方法，其包括如下步驟： 1)培養權利要求5所述的宿主細胞； 2 )回收所述多價EZH2腫瘤相關抗原肽； 優選地，步驟2)通過親和層析純化所述多價EZH2腫瘤相關抗原肽。
【專利摘要】一種多價EZH2腫瘤相關抗原肽,涉及免疫學領域。具體而言，本發明涉及包含4條EZH2腫瘤相關抗原肽的多價EZH2腫瘤相關抗原肽。本發明還涉及編碼所述多價EZH2腫瘤相關抗原肽的分離的核酸，包含所述核酸的構建體和載體，以及包含所述核酸的宿主細胞。本發明還涉及所述多價EZH2腫瘤相關抗原肽的制備方法及其用于制備藥物組合物或疫苗的用途。
【IPC分類】C12N15/54, C07K16/06, C07K16/40, C12N15/70, A61K39/00, A61P35/00, C12N1/21, C12N9/10
【公開號】CN105602915
【申請號】CN201511027007
【發明人】王艷林, 楊文 , 馬小猛, 李倩, 楊建林
【申請人】三峽大學
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年12月31日