發現:成功設計和制備了一種多價EZH2腫瘤相關 抗原肽，并建立了高效合成和有效分離純化該種抗原肽的方法。
[0017] 因此，在一個方面，本發明涉及一種多價EZH2腫瘤相關抗原肽，其由4種EZH2腫瘤 相關抗原肽Aal20-128，Aal65-174，Aa291-299和Aa735-742,以及任選的標簽、任選的接頭 和任選的信號肽組成；其中Aal20-128的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示;Aal65-174的氨基 酸序列如SEQIDN0.3所示;Aa291-299的氨基酸序列如SEQIDN0.5所示 ;Aa735-742的氨 基酸序列如SEQ ID N0.7所示。優選地，所述多價EZH2腫瘤相關抗原肽由如SEQ ID N0.9所 示的氨基酸序列及標簽組成。優選地，所述標簽為6 X His標簽。優選地，所述多價EZH2腫瘤 相關抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示。
[0018] 在另一個方面，本發明提供了編碼如上所定義的多價EZH2腫瘤相關抗原肽的多核 苷酸;優選地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。還提供的是包含此類多核 苷酸的構建體。
[0019] 在另一個方面，本發明提供了一種載體，其包含編碼如上所定義的多價EZH2腫瘤 相關抗原肽的多核苷酸或者含有此類多核苷酸的構建體。本發明的載體可以是克隆載體， 也可以是表達載體。
[0020] 在一個優選實施方案中，本發明的載體是例如質粒，粘粒，噬菌體，柯斯質粒等等。
[0021] 在另一個方面，還提供了包含本發明的多核苷酸或構建體或載體的宿主細胞或者 生物體。此類宿主細胞包括但不限于，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母 細胞，昆蟲細胞，植物細胞和動物細胞(如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等）。本發明 的細胞還可以是細胞系。在一個實施方案中，所述生物體是植物或者動物。
[0022] 在另一個方面，本發明還涉及一種藥物組合物或疫苗，其包含根據本發明的多價 EZH2腫瘤相關抗原肽，任選地還包含藥學可接受的載體和/或賦形劑。本發明的藥物組合物 或疫苗可以用于預防和/或治療腫瘤。
[0023]在另一個方面，本發明還涉及根據本發明的多價EZH2腫瘤相關抗原肽用于制備藥 物組合物的用途，所述藥物組合物用于預防和/或治療腫瘤。
[0024]在另一個方面，本發明還涉及預防和/或治療腫瘤的方法，其包括施用有效量的根 據本發明的多價EZH2腫瘤相關抗原肽或包含所述多價EZH2腫瘤相關抗原肽的藥物組合物。 [0025]在另一方面，本發明還涉及根據本發明的多價EZH2腫瘤相關抗原肽用于制備抗體 的用途;優選地，所述抗體用于預防和/或治療腫瘤。
[0026]在另一方面，本發明還涉及制備根據本發明的多價EZH2腫瘤相關抗原肽的方法， 其包括如下步驟：
[0027] 1)培養能夠表達根據本發明的多價EZH2腫瘤相關抗原肽的宿主細胞；
[0028] 2)回收所述多價EZH2腫瘤相關抗原肽；
[0029] 優選地，步驟2)通過親和層析純化所述多價EZH2腫瘤相關抗原肽。
[0030]在一個優選的實施方式中，上述方法具體包括如下步驟：
[0031] a)合成如下兩條DNA單鏈：
[0032] 5'-GGAAGATCTGTTTATGGTGGAAGATGAAACTGTTTTATTTATAAATGATGAAATTTTTGTGGAGTT GAAATATG(SEQ ID N0.11)，
[0033] 5'-CCGCTCGAGtcaGACATACTTCAGGGCATCAGCCTGCTTACGATGTAGGAAGCAGTCATATTTCAA CTCCACAAAA(SEQ ID NO.12)；
[0034] 用重疊延伸PCR技術獲得全長130bp的雙鏈DNA片段，純化重疊延伸PCR獲得的產物 并用Bglll和Xhol雙酶切消化后克隆入經相同酶消化的原核表達質粒pET30a( + )中，由此獲 得重組質粒 pET30a (+) -EZH2-ant i gen;
[0035] b)用pET30a( + )-EZH2-antigen轉染大腸桿菌，培養轉染獲得的大腸桿菌并用IPTG 誘導表達4h;
[0036] c)將步驟b)獲得的培養物離心收集菌體，裂解菌體細胞將獲得的細胞裂解液用 Ni-NTA樹脂進行親和層析，將獲得的蛋白樣品進行透析，并將透析后的蛋白樣品經SDS-PAGE鑒定并保存。
[0037] 優選地，步驟c)具體為將步驟b)獲得的培養物離心收集菌體，Buffer B (8mo 1/L尿 素，100mmol/L Na2HP〇4，10mmol/L Tris，pH8.0)重懸細菌，在37°C震搖2h裂解細胞，細胞裂 解液上Ni-NTA層析柱后，Wash Buffer(8mol/L尿素，100mmol/L Na2HP〇4,10mmol/L Tris,pH 6.3) 洗脫雜蛋白；然后用Buffer E(8mol/L尿素，lOOmmol/L Na2HP〇4，10mmol/L Tris，pH 4.3) 洗脫結合在Ni-NTA樹脂上的多價EZH2腫瘤相關抗原肽;將獲得的純化的蛋白樣品中包 含的尿素經透析逐步去除;透析后的蛋白樣品經SDS-PAGE鑒定并保存。優選地，用于透析的 緩沖液為含尿素梯度濃度的磷酸鹽緩沖液（l〇mmol/L Na2HP〇4，10mmol/L NaH2P〇4,5%甘 油，口!17.4，尿素濃度梯度為5.01]1〇1凡、2.51]1〇1凡、1.01]1〇1凡、0.01]1〇1凡），每種尿素濃度下于4 °C透析12h。
[0038] 發明的有益效果
[0039]目前用于制備蛋白的表達系統可以分為真核表達系統和原核表達系統。
[0040]在真核表達系統中表達的蛋白天然構象破壞少，往往只需進行簡單的純化過程即 可獲得具有正確構象的蛋白。但目前真核表達系統例如桿狀病毒表達系統和酵母表達系統 存在表達量低，培養成本高等缺陷，給大規模工業化生產帶來了極大困難。
[0041]本發明提供的多價EZH2腫瘤相關抗原肽及其制備方法有效地解決了上述問題。首 先，在原核表達系統中，尤其是大腸桿菌表達系統具有培養成本低，表達量大的優點。本發 明使用原核表達系統來表達多價EZH2腫瘤相關抗原肽，確保了其高表達量。其次，本發明采 用親和層析純化所述多價EZH2腫瘤相關抗原肽，獲得高純度的目的蛋白。進一步，根據本發 明的多價EZH2腫瘤相關抗原肽的分子量雖小但抗原肽密度高。用Westewrn Blot法(免疫印 跡法)證實，本發明原核表達的多價EAH2腫瘤相關抗原肽能被抗EZH2抗體有效識別和結合， 用這種多價EAH2腫瘤相關抗原肽免疫實驗動物后能在動物體內高效誘導合成相應抗體，因 而具有更強的腫瘤相關抗原的活性。它的成功研制將為腫瘤免疫治療研究提供新的實驗材 料，為腫瘤免疫治療新型藥物的研發奠定基礎，有重要的應用前景和開發價值。
[0042]下面將結合附圖和實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人 員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發明，而不是對本發明的范圍的限定。根據附圖 和優選實施方案的下列詳細描述，本發明的各種目的和有利方面對于本領域技術人員來說 將變得顯然。
【附圖說明】
[0043]圖1A顯示了 PCR重疊延伸技術獲得的編碼多價EZH2腫瘤相關抗原肽的DNA序列，其 中
[0044] 泳道M: lkb DNA Marker;
[0045] 泳道1-2:多價EZH2腫瘤相關抗原肽的編碼DNA。
[0046] 圖1B顯示了 DNA測序驗證多價EZH2腫瘤抗原肽的編碼序列（108bp)的結果。
[0047]圖1C顯示了多價EZH2腫瘤抗原肽的氨基酸序列及其編碼DNA序列。
[0048] 圖1D顯示了質粒pET30a( + )-EZH2_antigen的酶切鑒定結果；
[0049] 泳道M: lkb DNA Marker;
[0050] 泳道l:pET-30a( + )質粒經Hpa I+EcoR 頂每切（3932bp+1490bp);
[0051 ]泳道 2:pET30a( + )-EZH2-antigen 質粒經 Hpal+EcoR 頂每切（5447bp);
[0052] 泳道3:pET_30a( + )質粒（5422bp);
[0053] 泳道4:pET-30a( + )-Ezh2_antigen質粒（5447bp)。
[0054] 圖2顯示了用SDS-PAGE檢測在大腸桿菌BL-21(DE3)中用IPTG誘導表達目的蛋白的 結果；
[0055] 泳道1:IPTG誘導前；
[0056] 泳道2-5:0.3mmol/L IPTG 37Γ誘導4h;
[0057] 泳道 Μ:標準蛋白 Marker-431。
[0058]圖3顯示了 SDS-PAGE檢測多價Ezh2腫瘤相關抗原肽的可溶性的結果；
[0059]泳道 Μ:標準蛋白 marker-431;
[0060] 泳