藍蛋白質在酸性條 件下結合時，染色液的最大吸光值波長由465nm轉移至595nm，同時其顏色由褐色轉為藍色。 通過測定樣品的吸光值并對照標準蛋白的吸光值，推算出蛋白濃度。
[0090] (1)考馬斯亮藍溶液的配制
[0091] 稱取50mg考馬斯亮蘭G250完全溶于50mL乙醇（95%)至完全溶解，加入100mLH3P〇4 (85%)，加入蒸餾水至1L，4°C攪拌過夜，濾紙過濾后棕色瓶避光保存于4°C備用。
[0092] (2)牛血清白蛋白（BSA)標準曲線
[0093]以BSA作為標準蛋白繪制標準曲線。配制1 Omg/mL BSA溶液，分別吸取0、0.1、0.5、 0.75、1.0、1.25、1.5、211^并加水補足至1011^，得到濃度為0、0.1、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、 2mg/mL的BSA溶液，各吸取500yL后分別加入2.5mL考馬斯亮藍溶液，混合均勻后室溫下靜置 5min，在595nm處測定吸光度值，讀數在3~5min內保持穩定。得到的BSA標準曲線。
[0094]由實驗數據進行線性擬合，得到曲線方程:Y = 0.1514X-0.0158, R2 = 0.9946。測定 時待測蛋白液濃度需在〇. 1~2mg/mL范圍內。
[0095] 2、酶活測定（以野生型為準）
[0096] (1)重組酶催化體系設置
[0097] DBAT酶活力單位定義：在30°C條件下，每分鐘轉化lyM 10-DBA生成巴卡亭ΙΠ 的所 需的酶量定義為1U。
[0098] 根據不同目的改變體系內的變量，一般體系設置為：
[0099] Mg2+lmM，10-DAB 400μΜ，乙酰輔酶Α 400μΜ，純化后重組酶 10yL，Buffer定容至400μ L〇
[0100] (2)測定巴卡亭m生成量
[0101] 加樣后，輕輕震蕩混勻。30°C下反應lh。反應結束后，立即加入400yL乙腈終止反 應。0.22μπι微孔濾膜過濾樣品，進行HPLC-UV檢測。
[0102] 3、HPLC-UC測定巴卡亭m(以野生酶為準）
[0103] (1 )HPLC條件:采用HPLC-UV對巴卡亭ΙΠ 和10-DAB進行定性、定量，主要參數如下： 柱溫:室溫;檢測波長:227nm;流動相:MeCN: H20(50:50);流速：1. OmL/min;進樣量:20yL。
[0104] (2)標準品溶液的制備:分別準確稱量巴卡亭m和1 ο-DBA標準品適量，甲醇溶解， 均配置成lmg/mL母液。
[0105] (3)樣品溶液的制備：催化反應完成后，加入等體積乙腈，搖勻，終止反應。再用 0.45μπι微孔濾膜過濾，取濾液，即可。
[0106] (4)標準曲線:精密吸取巴卡亭m標準品母液2.5yL、5yL、1 OyL、15yL、20yL，用色譜 級甲醇定容至10mL。過濾后，分別按上述色譜條件測定，重復測定3次，取平均值。以標準品 巴卡亭m的進樣量(X)為橫坐標，峰面積積分值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，并對所測得的 數據進行線性回歸分析。
[0107] 同理繪制10-DAB標準曲線。
[0108] (5)精密度的考察:取巴卡亭m標準品溶液，精密吸取20yL連續進樣5次，分別按上 述色譜條件進行檢測，考察方法的精密度。
[0109] (6)加樣回收率:精密稱量己知含量的樣品，適量加入巴卡亭m對照品，制備供試 品溶液，分別按上述色譜條件及測定方法進行測定，按下列公式計算回收率：
[0110] 巴卡亭ΓΠ 的加樣回收率= 加入的巴卡苧ΙΠ 量
[0111]結果與分析：
[0112] 由圖1可知，野生型DBAT在發生氨基酸替換后對其可溶性表達及表達量有影響。在 相同的濃度IPTG誘導后，所有突變體仍能夠正常表達。其中，D166A和H162AR363H(簡寫為 HARH)的可溶表達量均減少。相反的是，D166H、R363H和D166HR363H(簡寫為DHRH)可溶表達 量都增加。結果表明R363位點替換成His或者Ala都能增加 DBAT的可溶表達，D166位點替換 成Ala可溶表達量減少，替換成His時則增加。
[0113] 分別將這些突變體誘導、表達和純化(圖2)，進行酶學性質測定。
[0114] 實施例4DBAI1酶的酶學性質分析 [0115]( - )動力學參數的測定
[0116] 以10-DAB和乙酰輔酶A為底物，在pH 7.4，0.5mol/L磷酸鈉緩沖液中，于30 °C反應 1 h條件下，按照上述酶活力測定方法，測定突變酶在2~1 Ommo 1 /L底物濃度下產物巴卡亭 ΠI的生成量，重復測定3次。采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法計算酶的Km、Vmax和kcat 〇
[0117] (二)突變酶最適反應溫度的測定
[0118] 取適量純化后的突變酶加入到磷酸鈉緩沖液(0.5111〇1/1，？!17.4)中，并在不同的 溫度(l〇°C~60°C，間隔10°C)條件下，分別設置6個反應體系，測定其最適反應溫度，10-DAB 和乙酰輔酶A的濃度均為400ymol/L 10-DAB，參照上述測定其酶活力，重復測定3次。以突變 酶在不同溫度條件下所測得的最高酶活力為100%，其它值與之比較得到的相對值作圖。 [0119](三)突變酶的最適反應pH的測定
[0120]為了測定突變酶的最適pH值，我們在標準狀態下，以1.2M的蔗糖為底物30°C水浴 反應60min后，對蔗糖磷酸化酶水解反應的最適pH進行了摸索。將純化后的突變酶在不同的 pH(4.0~9.0)條件下進行酶促反應測定其最適pH值，所使用的緩沖液為0.5mol/L醋酸鹽緩 沖液4訊4.0~5.0);0.5111〇1/1磷酸鈉緩沖液4!1(6.0~8.0) ;0.5111〇1/11^8-!1(：1緩沖液， pH(8.0~9.0)。并參照上述測定其酶活力，重復測定3次。酶活最高的一組反應緩沖液pH值 為該酶的最適pH值設定酶活為100%，以此為標準制作不同pH值與酶相對活性關系曲線。
[0121] 結果與分析：
[0122] (一)突變酶的酶學性質測定
[0123] 利用上述純化的突變酶，分別以乙酰輔酶A和10-DAB為底物，進行酶學性質測定， 以研究這些理性設計位點是否能如預期效果。
[0124] (1)D166A
[0125] 突變體D166A對pH的影響。看出，該酶最佳反應pH是7,這和野生型DBAT-致。但是， 在酸性范圍內，其活力下降較明顯，這和野生型又有比較大的差別。如在pH=6時，野生型 DBAT的相對酶活約為70%，而D166A不到50% ;在pH=8時，野生型DBAT的相對酶活和D166A 相當。從酶對環境pH的適應角度來看，Asp屬于酸性氨基酸，Ala屬于脂肪族氨基酸，Aspl66 位點突變成Ala，不利于保持酶活性，降低了適應性。我們推測Hisl62發生親核攻擊，需要奪 取10-DAB上醇羥基的氫，而在酸性環境下，這一機制極有可能受到干擾，從而使酶活降低。
[0126] 另外，我們考察了D166A的最適溫度。表明D166位點突變成Ala，并未對溫度適應性 有明顯的影響。
[0127] (2)D166H
[0128] 為進一步驗證D166位點是否為活性殘基H162提供反應的微環境，我們設想，把酸 性氨基酸Asp替換成堿性氨基酸(如His)同樣會影響酶對環境pH的適應性。我們繼續測定了 D166H的最適PILD166H的最適pH為7,這和野生型DBAT和突變體D166A-致。所不同的是，在 pH=6時，D166H的相對酶活還保留在80%以上，這明顯高于野生型DBAT和D166A;而在pH=8 時，0166!1的相對酶活力卻下降到了50%左右，這低于野生型0841'和01664。因此，我們認為， D166位點不僅維持了蛋白的高級構象，而且在Hisl62發生親核攻擊的時候，為其提供了一 定的微環境。
[0129] 另外，我們測試了 D166H的最適反應溫度。可以看出，其最適溫度是30°C，這和野生 型DBAT和D166A-致。但在較低溫度下，還能保持較高的酶活，我們猜測，D166突變成His后， 更利于維持其構象。
[0130] (3)R363H
[0131] pH對突變體R363H酶活的影響。看出，R363H表現出的性質和野生型完全不同，該酶 最佳反應pH是3,這和野生型DBAT相差很遠。在酸性范圍內，R363H的活力較高，而在堿性環 境中，活性完全消失，這和野生型完全不同。
[0132] His的pKa是6.04，屬于弱堿性氨基酸。Arg的pKa是12.48，屬于堿性氨基酸。在堿性 環境下，Arg363位點突變成His后，不利于His的質子化，從而使得酶活性大大降低。這也說 明除了環境pH對酶活性有影響之外，在酶活性中心附近的氨基酸殘基(D166和R363)同樣為 His提供了可供其質子化的微環境，這也在一定程度上決定了酶對環境pH的適應性。
[0133] 另外，我們研究了溫度對R363H酶活性的影響。可知，R363H的最適溫度是30°C，這 和野生型的一致。但在較高溫度（如30~50°C)下，R363H還能保持70%以上的酶活性，而野 生型均下降到50 %以下。這表明R363H擁有更高的溫度適應性。
[0134] (4)H162AR363H
[0135] 根據Hi s催化的酰基轉移原理，我們構建了雙突變位點突變體Η16 2AR36 3H，其中， 替換了原有的活性殘基Η162Α，同時在R363的位置引入新的擬活性殘基His。酶學性質測定， 表明H162AR363H具有活性，即新引入的活性殘基可以正常發揮作用。我們進一步研究了 pH 對其酶活的影響。可知，H162AR363H的最適pH為6，而且在酸性環境下（如pH=4~6時