），仍然 具有較高的活力。和Hisl62相比，Alal62改善了活性殘基附近的微環境，增加了在較高環境 pH下的適應性。
[0136] 溫度對H162AR363H的影響。可知，其最適溫度為30°C，這和野生型DBAT及R363H并 沒有差別。
[0137] (5)D166HR363H
[0138] His殘基首先質子化，再奪取乙酰輔酶A上羰基碳的電子。利用定點突變技術，在 DBAT中同時引入2個His位點，這和原有的Hisl62-起，極有可能提升酶活性。
[0139] 我們僅以研究了pH對其活性的影響。可知，突變體D166HR363H的最佳pH是6,這和 H162AR363H-致，和R363H(pH=3)和野生型DBAT(pH=7)相差較大。推測這和Hisl66殘基同 樣改善了反應微環境，說明Hi s 162、His 166和Hi s363彼此形成微環境，His在酸性環境下更 易質子化，從而發動親核攻擊。
[0140] 溫度對D166HR363H酶活性的影響。可知，其最適溫度為30°C。這和上述所有的突變 體一樣，表明這些位點的突變不能改變酶分子對溫度的適應性。
[0141] (6)理性改造酶的酶學動力學常數
[0142] 根據DBAT的酰基轉移機理，通過對非天然酰基供體的利用分析，我們認為酰基供 體上的羰基氧距離活性殘基的距離和酶的活性呈現線性相關。在野生型DBAT中，H162、D166 和R363距離乙酰輔酶A的距離相當，自然這就成了酶理性設計的起點，于是就構建了 !116241?363!1、01664、0166!1、1?363!1和0166邢363!1等5個理性設計的酶。
[0143] 在經過大量表達，純化后，我們對上述突變體的米氏常數、催化效率等性質進行了 表征(表2)。結果表明，在H162AR363H中，單一催化位點H363同樣可完成催化，表現出和WT相 當的催化效率。將酶的活性殘基增加到兩個后，即單點突變D166H與R363H，酶的效率常數比 野生型增加了 11倍和12倍，催化效率相似。繼續增加到三個后，酶的效率常數提高了 39倍， 表明將兩個活力提高的突變具有加和作用或者協同作用，簡單的累加可以進一步提升其催 化活性。
[0144] 表2突變體的催化效率表征
[0145]
[0146] (二)非天然底物拓展
[0147] (1)H162AR363H
[0148] 雖然乙酰輔酶A可作為H162AR363H的酰基供體，且其轉化效率和WT相當。但測試的 酰基供體1、酰基供體2、酰基供體3、酰基供體4、酰基供體5、酰基供體6和酰基供體7均不能 被突變體利用。推測這些化合物產生醛類導致活性殘基被破壞。
[0149] (2)D166H
[0150] 突變體D166H對酰基供體2、酰基供體3、酰基供體4和酰基供體6的轉化效率極低， 幾乎不能被利用。但對酰基供體1、酰基供體5和酰基供體7有較高的催化效率（圖3)。從圖中 可看出，隨著添加量的遞增，轉化效率也相應增加。
[0151] (3)R363H
[0152] 突變體R363H均能利用酰基供體1、酰基供體2、酰基供體3、酰基供體4、酰基供體5、 酰基供體6和酰基供體7。其中，對酰基供體1和酰基供體7有較高的催化效率(圖4)。
[0153] 我們進一步分析了突變體R363H對不同酰基供體的偏好性。可知，R363H對酰基供 體1和酰基供體5具有較高的催化活性，其次是酰基供體7。這個與野生型的DBAT相似，我們 認為酰基供體的側鏈結構越復雜，轉化成產物的效率越高。
[0154] (4)D166HR363H
[0155] 我們同樣測試了雙突變體D166HR363H對酰基供體利用情況。結果表明，該突變體 均能較為高效的利用酰基供體1、酰基供體2、酰基供體3、酰基供體4、酰基供體5、酰基供體6 和酰基供體7。其中，當酰基供體6的添加量超過1 %時和酰基供體7添加量超過2.5 %時，產 量均逐漸下降（圖5)。表明該突變體對不同的酰基供體具有不同的耐受性。
[0156] 同理，我們進一步分析了突變體D166HR363H對不同酰基供體的偏好性。可知， D166HR363H對酰基供體1、酰基供體5和酰基供體7具有較高的催化活性。這個與野生型的 DBAT、R363H 相似。
[0157] (三)進化路線
[0158] Kcat/Km是酶的催化效率常數（specif icity constant)。對于同一底物而言， Kcat/Km值越大，表示酶的活性越大。以乙酰輔酶A為酰基供體，突變體H162AR363H和WT相 當，表明R363位點可以作為新的催化位點。而D166H和R363H分別比WT提高了大約11倍和12 倍，這表明這兩個位點均可以設計為新的活性殘基。D166和R363結合起來，比WT提高了約39 倍，這不僅表明對酶的設計和改造是合理的，而且進一步確認了在DBAT催化的中，His是發 動親核攻擊的關鍵殘基，在合理的范圍內，增加 His的數目，可以增加酰基供體的羰基氧受 至IjHis的咪唑基團的攻擊的機會，從而增加酶的活性。
[0159] 另外，我們那把這些設計酶進行非天然酰基供體的測試。結果表明，H162AR363H對 多數均不能催化，推測這是因為這些烯醇酯產生了醛類，破壞了新引入的H363殘基，從而導 致活性下降。而對于D166H、R363H和D166HR363H來說，均在不同程度上提高了對這些非天然 底物的利用率(圖6)。其中，野生型的對酰基供體7沒有活性，而這三個突變體均能較高效的 利用。酰基供體1的利用率分別提高了74、100和143倍，推測在較多數目的活性His下，羰基 氧更容易受到親核攻擊。
[0160](四）結論
[0161] 通過理性設計快速有效的提升酶的催化活力一直是蛋白質工程領域的研究熱點。 它不僅能夠為加深理解酶分子的結構與功能關系提供可具體案例，同時也能為工業生產提 供優秀的新酶源。在本章中，我們利用分子對接的方法，快速準確的在酶活性中心找到靶標 位點，即D166和R363。通過定點突變技術，獲得了突變體，并對突變體進行性質表征。其中， 以乙酰輔酶A為酰基供體，H162AR363H的催化效率和野生型相當，而D166H、R363H和 D166HR363H的催化效率均比野生型提高了 11倍、12倍和39倍。對于非天然底物，這些突變體 表現出不同的性質，多數能同樣增加效率。對于這再一次證明了針對活性中心的改造是一 種迅速、高效的進化酶活性的方法。
[0162] 另外，DBAT催化的酰化作用是有其關鍵殘基Hisl62主導的。在不改變酶分子的溶 劑通道的前提下，通過在有效的范圍內，僅僅簡單的增加 His數目就可以疊加酶的效率，因 此，本例也成為一個極具代表性的案例。在理解酶結構-功能關系的基礎上，通過對酶活性 中心的改造，將為未來蛋白質工程提供有效的指導。
[0163] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種DBAT突變酶R363H，其特征在于：所述的DBAT突變酶R363H是氨基酸序列為SEQ ID N0:2的DBA!1酶的第363位氨基酸由Arg改變為His;其氨基酸序列為SEQ ID N0:14。2. 編碼權利要求1所述的DBAT突變酶R363H的基因，其特征在于：其核苷酸序列為SEQ ID N0：13〇3. -種用于在宿主細胞內表達權利要求1所述的DBAT突變酶R363H的重組質粒。4. 根據權利要求3所述的重組質粒，其特征在于:所述的重組質粒攜帶有權利要求2所 述的基因。5. -種工程菌株，其特征在于:所述的工程菌株攜帶有權利要求4所述的重組質粒。6. 根據權利要求5所述的工程菌株，其特征在于:所述的工程菌株為TBL21-R363H，其宿 主菌為大腸桿菌BL21。7. 權利要求1所述的DBAT突變酶R363H在催化10-DAB合成巴卡亭ΙΠ 中的應用。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述的催化10-DAB合成巴卡亭ΙΠ 中的酰基 供體為乙酰輔酶A，所述的DBAT突變酶R363H的催化效率比DBA!1酶提高了12倍。9. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述的催化10-DAB合成巴卡亭ΙΠ 中的酰基 供體為乙酸乙烯酯，所述的乙酸乙烯酯的利用率提高了 100倍。10. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述的催化10-DAB合成巴卡亭ΙΠ 中的酰 基供體為乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸仲丁酯、乙酸戊酯、乙酸異戊酯或乙酸異丙烯酯。
【專利摘要】本發明公開一種DBAT突變酶R363H及其應用。所述的突變酶是氨基酸序列為SEQ？ID？NO：2的DBAT酶的第363位氨基酸由Arg改變為His；其氨基酸序列為SEQ？ID？NO：14。本發明成功構建出突變酶R363H。該突變酶在利用乙酰輔酶A的催化效率上比野生型酶提高了12倍，大大提高了乙酰輔酶A的使用率和產物巴卡亭Ⅲ的產量。同時，為降低生產成本，本發明尋找了7種新型酰基供體，突變酶均能高效利用這些酰基供體，其中對乙酸乙烯酯的利用率提高了100倍，能作為替代昂貴的乙酰輔酶A用于制備巴卡亭Ⅲ。迄今為止，在生物合成巴卡亭Ⅲ的研究中，并未發現有以非植物輔酶類為酰基供體并體現高利用率的研究。
【IPC分類】C12P17/02, C12N1/21, C12N15/70, C12N15/54, C12N9/10
【公開號】CN105602916
【申請號】CN201610031523
【發明人】林俊芳, 郭麗瓊, 尤琳烽, 葉志偉, 黃佳俊
【申請人】華南農業大學
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月15日