?Cycle Pure Kit純化， 測定回收濃度后備用。
[0045] 分別在陰性對照和P C R回收產物中，加入D ρ η I限制性內切酶（10 U / μ L，可不加 buffer)，在37°C金屬浴中消化lh。利用DNA凝膠電泳檢測酶切情況。
[0046](二)測序驗證突變酶載體構建成功
[0047]將消化后的PCR產物轉化至E.coli DH5a感受態細胞中，涂板培養過夜，挑取擬陽 性克隆子進行測序驗證，確定成功獲得突變酶表達載體。
[0048](三)獲得突變菌株
[0049] 酶切鑒定和測序鑒定后，重組質粒轉化E.coli BL21菌株，獲得DBAT突變酶的重組 表達菌株。
[0050] 表1獲得DBAT突變酶所用到的引物
[0051]
[0052]結果分析：
[0053] (一)活性中心正四面體
[0054] 活性中心是酶催化的核心部位，其特定的構象不僅有助于底物結合，還能促進酶 的高效催化。然而，酶活性中心細微的變化也可能會帶來酶的性質很大的變化(甚至影響酶 正常的生物學功能），因此，一般盡可能避免改造活性位點（Schmid，2011)。
[0055] 20世紀初，在對大量不同類型酶在變性過程中的活力、構象變化進行研究，學者們 發現酶的失活往往發生在可檢測的蛋白質整體構象變化之前，即酶是先失活，后變性。這表 明，酶活性中心的構象脆弱性可能是導致酶失去活性的根本原因 (Benkovic et al. ,2003; C.-L.Tsou，1998;C.Tsou，1993)。因此，我們認為在不破壞活性中心的構象的前提下，對酶 的適當理性設計，不但可能不會破壞酶的活性，還可能改變酶的活性。
[0056]其中，我們發現，當D166和R363突變成Ala后，酶活均下降；分子對接結果表明， D166和R363均與乙酰輔酶A形成疏水作用。進一步的定點突變實驗表明，這兩個位點的突變 仍然能保留一部分活力，因此，這種疏水作用并不完全決定整個酶促反應過程能否進行。 [0057] 另外，我們發現，在野生型DBAT中，H162、D166和R363與乙酰輔酶A硫酯鍵的距離相 當，而且這三個氨基酸殘基的距離也相近，構成正四面體結構。我們推測，這兩個位點可以 被改造。尤其是DBAT催化乙酰輔酶A的酰基轉移是由單個His發起，這些為引入新的催化位 點提供了理論基礎。
[0058] (二)D166 位點
[0059] (1)D166A
[0060]我們首先利用同源建模，獲得D166A突變體的三維結構。再和乙酰輔酶A為底物進 行分子對接。突變后Alal66和乙酰輔酶A形成作用力，這和Ala屬于疏水性氨基酸有關。和野 生型相比，D166A中口袋內的氨基酸，略有變化。推測這和活性下降有關。
[0061] 從距離上看，Hisl62和乙酰輔酶A的S原子的距離為3.8A。這比野生型更近，理論上 講，這更利于Hisl62發動親核攻擊。而Alal66的距離同樣變近，增大了空間位阻效應，推測 這些均和活性下降有關。
[0062] (2)D166H
[0063] 根據野生型DBAT和D166A的對接結果，D166(或A166)位點距離乙酰輔酶A較近，于 是，我們設想，把D166突變成His后，可能會形成兩個活性位點，理論上同樣有可能參與反 應。
[0064] 首先利用同源建模，獲得D166H的三維結構。D166H和WT(野生型DBA!1酶）的骨架的 RMSD值為0.161A,表明突變并沒有引起蛋白結構的劇烈變化。再和乙酰輔酶A進行分子對 接。突變后Hisl66和乙酰輔酶A形成疏水作用力，這和His屬于疏水性氨基酸有關，推測這極 有可能改變原有酶學性質。和野生型相比，D166H中，形成口袋的氨基酸殘基數目和種類并 沒有較大的改變。
[0065] 從空間距離來看，在D166H中，導致Hisl62和乙酰輔酶A的距離是4.7A。這和野生型 DBAT相比，更近的距離更利于發動攻擊。另外，新引入的氨基酸殘基Hisl66同樣距離乙酰輔 酶A較近，也即是說，乙酰輔酶A的羰基有可能同時受到兩個組氨酸的親核攻擊，這可能會導 致酶活的提高。另外，天冬氨酸和組氨酸分別帶負電和正點，這意味著酶的最適pH可能會發 生變化。
[0066] (三)R363位點
[0067] (1)R363H
[0068]在野生型DBAT中，R363處于溶劑通道內，和乙酰輔酶A形成疏水作用力。而將其突 變成Ala后，導致酶活下降，表明R363并不決定反應能否進行。我們設想，將其突變成His后， 可能會改變酶學性質。首先進行同源建模，R363H和WT的骨架的RMSD值為0.226人，表明突變 并沒有引起蛋白結構的劇烈變化，再和乙酰輔酶A對接，His363同樣和乙酰輔酶A形成疏水 作用力。和野生型DBAT相比，口袋內的氨基酸略有變化。另外精氨酸的pKa = 12.5，而組氨酸 的pKa = 6.1，推測突變可能會引起酶的最適pH的變化。
[0069] 進一步考察了 Hisl62和His363到乙酰輔酶A的距離，分別為4.7A和5.0A,這表明， 乙酰輔酶A可同時受到兩個His(新引入的His363和原有Hisl62)的攻擊，可能會導致酶學性 質的改變。
[0070] (2)H162AR363H
[0071] Hisl62是DBAT的關鍵殘基，將其突變后酶活完全丟失。而His上的咪唑基是發動攻 擊的直接參與者。我們猜想，將原有Hisl62突變導致酶活丟失，再將口袋內和乙酰輔酶A的 較近的R363殘基突變成His，可能會導致酶活的恢復。
[0072] 同樣，首先利用同源建模，構建H162AR363H的三維結構，H162AR363H和WT的骨架的 RMSD值為0.228A,表明突變并沒有引起蛋白結構的劇烈變化。再和乙酰輔酶A進行對接。新 引入的His363和乙酰輔酶A之間形成作用力，表明這一新活性位點可能會發揮催化作用。而 Aspl62位點雖然被突變成Ala，但新引入的Alal62同樣參與和底物的結合過程。
[0073] His363距離乙酰輔酶A的距離為4.5 A，這一距離使得His的咪唑基團能有效接觸到 乙酰輔酶A的羰基碳，進一步表明這一位點可能會參與酰基轉移過程。
[0074] (3)D166HR363H
[0075] 從乙酰輔酶A和上述各個突變酶的對接結果來看，單個突變并不會對整個蛋白的 三維結構有大的影響，反而這些位點可能是理性改造酶的最佳候選位置。我們設想，在DBAT 的溶劑通道內，同時引入3個His，而且這3個His均距底物的距離足夠小，就增加乙酰輔酶A 被任意一個His殘基親核攻擊的可能，從而提升酶活。
[0076] 因此，我們利用同源建模構建了 D166HR363H雙突變酶，D166HR363H和WT的骨架的 RMSD值為0.249A,表明突變并沒有引起蛋白結構的劇烈變化。再將其和乙酰輔酶A進行對 接，Hisl62、Hisl66和His363三個氨基酸殘基均和乙酰輔酶A形成作用力。
[0077] Hisl62、Hisl66和His363和乙酰輔酶A的距離分別為5 (、A，9.1 A和40A,這均足以 讓乙酰輔酶A受到這三個氨基酸殘基的親核攻擊。因此，我們認為，理論上來說，D166HR363H 雙突變酶的活性同樣會增加。
[0078] 實施例3突變酶工程菌株TBL-R363H的發酵驗證及酶活分析
[0079](一)工程菌株的發酵、蛋白誘導及純化 [0080] 1、蛋白誘導表達
[0081 ] 用重組質粒轉化表達宿主E.coli BL21，獲得的重組表達菌株TBL21-R363H。按照 1%接種量將陽性克隆菌液接種到l〇〇mL LB液體培養基中（加入100yg/mL的氨芐青霉素）， 37°C，220rpm培養至0D600 = 0.6~0.8左右，加入終濃度為ImM誘導劑IPTG，28°C誘導3h。
[0082] 在4°C，8000rpm離心10min收集菌體，每100mL原始發酵液加入20mL磷酸緩沖液 (PBS，pH 7.4)進行重懸。利用超聲細胞破碎儀對重懸菌體進行破碎，總超聲時間12min，工 作6 s，間隔6 s，功率4 0 0 W，超聲過程中菌液始終保持冰浴。破碎后按4 °C，12 0 0 0 r p m離心 10min，分別收集上清和沉淀。分別對上清和沉淀進行分離膠濃度為8%的SDS-PAGE蛋白質 電泳，檢測DBAT突變酶在表達系統E. coliBL21中的表達情況。
[0083] 2、蛋白純化
[0084] 經過SDS-PAGE檢測后，按上一步操作重新誘導蛋白。細胞裂解液替換成（50mM NaH2P04，300mM氯化鈉，10mM咪唑，ImM PMSF，pH8.0)。破碎細胞，離心收集上清液。
[0085] 先裝好層析柱（lcmXIOcm)，柱材料用量為5~10mg/l mL，用細胞裂解液平衡柱 子。將離心得到的上清酶液上樣掛柱，用5倍柱體積的緩沖液A沖洗鎳柱以清除非特異結合 的雜蛋白，接適量蛋白流出液并做好標記，分光光度計測定蛋白濃度，同時進行SDS-PAGE檢 測雜蛋白的洗脫情況。洗脫完之后用5~10倍柱體積緩沖液B徹底洗脫鎮柱，洗脫完之后的 鎮柱用5~10倍柱體積的20%乙醇沖洗后置于4°C保存。
[0086]將經過SDS-PAGE蛋白電泳驗證的收集管中的蛋白洗脫液合并于超濾管（lOKDa)中 進行4 °C超濾濃縮。當洗脫液濃縮至約lmL左右時加入9mL濃縮緩沖液(20mM酸鈉，200mM氯化 鈉和10%甘油)繼續濃縮，重復兩次。最后將酶液濃縮至lmL左右加入甘油至終濃度為20%， 分裝于菌種保存管中，置于_80°C保存。
[0087](二)突變酶的酶活分析 [0088] 1、蛋白濃度測定
[0089]采用Bradford法進行蛋白含量的測定。主要原理是當考馬斯亮