理是在退火反應體系中進行的，在此過程中，步驟 S01中設計的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列在該退火反應體系中形成雙鏈寡核苷 酸。
[0039] 在一實施例中，該退火反應體系除了包括上文所述正向寡核苷酸序列和反向寡核 苷酸序列之外，還包括NaCl和Tris-Cl試劑，在具體實施例中，該退火反應體系如下文實施 例1中表1中所示的試劑。在進一步實施例中，該退火反應的程序為:90°C4min，70 °C 1 Omin， 55°C10min，40°C10min，25°C10min。通過對退火反應體系和條件的控制，能有效提高退火反 應效率。
[0040] 在一實施例中，上述步驟S03中酶切pCas9/gRNAl載體的酶選EcoRV。其中，pCas9/ gRNAl載體的圖譜如圖2所示，該EcoRV在圖2所示的酶切位點進行酶切，酶切后用瓊脂糖凝 膠回收線性化載體。
[0041 ]在一實施例中，上述步驟S04中的連接反應體系除了包括上文所述的雙鏈寡核苷 酸和線性化載體之外，還包括T4 DNA連接酶、EcoRV、連接酶Buffer、PEG4000試劑，在具體實 施例中，該連接反應體系如下文實施例1中表2中所示的試劑。在進一步實施例中，該連接反 應的條件為:22°C30min，37°C15min。通過對連接反應體系和條件的控制，能有效提高連接 反應效率。
[0042]上述步驟S05中感受態細胞可以是本領域常用的感受態細胞，在一具體實施例中， 該感受態細胞可以是大腸桿菌DH5a感受態細胞。將被轉化后的大腸桿菌DH5a感受態細胞在 氨芐抗性的瓊脂平板上37°C培養轉化后，大約14-16小時后平板上出現單個細菌菌落。挑取 多個菌落至氨芐抗性的培養基中培養后進行PCR鑒定，篩選陽性細胞進行擴大培養，然后獲 取質粒，此時，該質粒為pCas9/gRNAl-XBPl質粒。
[0043]上述步驟S06的轉染培養處理的步驟中，被轉染后的DC細胞在pCas9/gRNAl_XBPl 質粒的作用下，DC細胞中的XBP1基因被敲除。
[0044] 為了提高轉染率，在一實施例中，在轉染過程中，向轉染體系中還加入L189試劑。 在進一步實施例中，加入的L189試劑在所述轉染培養體系中的濃度為0.1μΜ-10μΜ。向轉染 培養體系中加入L189試劑后，該L189可靶向作用于DNA連接酶Ι、ΙΙΙ和IV的DNA結合域，降低 這三種DNA連接酶與DSBs的親和力，從而抑制它的功能。因此，將L189與CRISPR/Cas9系統共 同轉進細胞可通過阻礙NHEJ而增強HDR的發生頻率，大大提高基因編輯的精準性，從而提高 DC細胞中的XBP1基因被敲除率。通過進一步控制L189在轉染體系中的濃度，以實現進一步 提高DC細胞中的XBP1基因被敲除率。
[0045] 上述L189試劑（別名：6_Amin〇-2，3-dihydr〇-5-[ (phenylmethy lene)amino]-2_4 (lH)-pyrimidineone)分子結構式為如下結構式A〇
[0046]
[0047] 在上述DC細胞XBP1基因敲除方法的各實施例中，在一實施例中，控制轉染體系中 pCas9/gRNAl-XBPl質粒加入DC細胞的濃度為10-20μg/ml。通過優化pCas9/gRNAl-XBPl質粒 的濃度，以實現提高對DC細胞的轉染率。
[0048]在另一實施例中，上述各實施例中的轉染體系包括Polyfect-V轉染試劑4.8ul， Alys505培養基。
[0049]因此，上述本發明實施例DC細胞XBP1基因敲除方法采用CRISPR/pCas9基因敲除系 統，利用本發明pCas9/gRNAl-XBPl質粒對DC細胞進行轉染，從而能高效的敲除DC細胞內的 XBP1基因，從而有效保證了DC細胞的免疫刺激作用，有效發揮了DC細胞抗腫瘤免疫作用。優 選的向通過向轉染培養體系中還加入L189試劑，該L189試劑能夠與CRISPR/pCas9基因敲除 系統發揮增效作用，顯著提高了有效提高了CRISPR/pCas9基因敲除系統敲除XBP1基因的效 率。
[0050] 現以具體的PCas9/gRNAl-XBPl質粒及其制備方法和DC細胞XBP1基因敲除方法為 例，對本發明做進一步詳細說明。
[0051 ] 實施例1
[0052]本發明實施例1提供一種DC細胞XBP1基因敲除方法，包括如下步驟：
[0053] S11.基因敲除靶點和寡核苷酸設計
[0054] 以內質網壓力感受因子XBP1為革巴基因，通過在線軟件(http://crispr.mit.edu) 針對XBP1基因進行CRISPR靶向序列設計和脫靶位點預測。經過綜合分析最終選擇的靶向序 列如下劃線所示。
[0055] "··.CGGTGCGCGGTGCGTAGTCTGGAGCTATGGTGGTGGTGGCAGCCGCGCCGAACCCGGCCGACGGGACCCCTAA AGTTCTGCTTCTGTCGGGGCAGCCCGCCTCCGCCGCCGGAGCCCCGGCCGGCCAGGCCCTGCCGCTCATGGTGCCAG CCCAGAGAGGGGC..."(SEQ ID NO：1)
[0056] 設計的插入寡核苷酸序列如下：
[0057]正向寡核苷酸序列為：
[0058] 5 ' GAAACACCGCCGCGCCGAACCCGGCCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGT CCGTT3，
[0059]反向寡核苷酸序列為：
[0060] 5 ' AACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCGGCCGGGTTCGGCGCGGCGGT GTTTC3'
[0061] S12.pCas9/gRNAl基因敲除載體連接和鑒定
[0062] S121寡核苷酸退火
[0063] 用水將步驟S11設計的寡核苷酸稀釋為100μΜ。按以下表1所示的體系配制退火反 應體系：
[0064] 表 1
[0065]
[0066] 將配制好的退火反應緩沖液重復混合，短暫離心后放至PCR儀上，運行以下程序： 90°C4min，70°C10min，55°C10min，40°C10min，25°C10min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用 或者在-20°C長期保存。
[0067] S122酶切線性化載體
[0068]用EcoRV酶切2yg PCas9/gRNAl載體(具體圖譜見附圖1)。酶切后用瓊脂糖凝膠回 收線性化載體。將回收后的線性化載體定量至濃度為500ngAU。
[0069] S123 連接
[0070] 用水將步驟S121退火后雙鏈寡核苷酸（ΙΟμΜ)稀釋100倍備用。按照以下表2所示的 體系配制連接反應體系：
[0071] 表2
[0072]
[0073] 反應條件：22 °C 30min，37 °C 15min。
[0074] S124轉化感受態細胞及PCR鑒定陽性克隆
[0075]用步驟S123連接后產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞。在氨芐抗性的瓊脂平板上 37°C培養轉化后細菌，大約14-16小時后，平板上出現單個細菌菌落。挑取多個菌落至氨芐 抗性的培養基中培養后進行PCR鑒定。
[0076] 鑒定引物：
[0077] gRNA-F GACTATCATATGCTTACCGTAACT
[0078] gRNA-R CAAGTTGATAACGGACTAGCCTTA
[0079] 陽性克隆鑒定產物大小為190bp，陰性克隆無條帶。
[0080] 將鑒定正確的陽性克隆擴大培養后提取pCas9/gRNAl-XBPl質粒，用于后續細胞轉 染。
[0081] SI 3 .DC細胞培養
[0082] S131抽取健康志愿者外周血50ml，肝素抗凝，室溫離心(700g，20min);吸取上層血 漿，置于水浴鍋中56°C，30min;然后4°C靜置15min后，離心(900g，30min)，取自體血漿4°C保 存備用；
[0083] S132取上述700g，20min離心后下部細胞成分，加 D-PBS至50ml，混勻，緩慢加到2個 裝有20ml人淋巴細胞分離液的50ml離心管中，室溫離心(800g，15min);
[0084] S133吸取白膜層細胞，加入到裝有5ml RPMI 1640的50ml離心管中；
[0085] S134加入RPMI 1640至總體積為50ml，離心（600g，10min)，棄上清液；
[0086] S135加入50ml RPMI 1640,離心（600g，10min)，棄上清液；
[0087] S136用含10%自體血漿的4178_505培養液重懸細胞，分裝入六孔板中，5\106/ ml，2ml/孔，置于飽和濕度、37°C、5.0 % C02培養箱中培養2h;
[0088] S137洗滌并收集未貼壁的細胞進行T細胞培養。保留貼壁細胞于六孔板中，加入含 100ng/ml GM-CSF、10ng/ml IL-4、及10%自體血漿的Alys-505培養液，置于飽和濕度、37 °C、5.0 % C02培養箱中繼續培養；
[0089] S138Day3:半量換液并補充新鮮的細胞因子，置于飽和濕度、37°C、5.0 %C02培養 箱中繼續培養；
[0090] S139 Day5:收集DC細胞，計數，PBS離心洗滌細胞（1500rpmX10min)，以含lOOng/ 111161-03?、10即/111111^-4及10%自體血漿的41 78-505培養液重懸細胞，分別接種于6孔板 中，1 X 106個細胞/孔，2ml/孔;共設三組。
[0091] S14.DC細胞XBP1基因敲除
[0092] S141 DC的分組情況如下：
[0093] (1)陰性對照組；（NC-DC)
[0094] (2) pCas9/gRNAl -XBP1 組；（XBP1 -DC)
[0095] (3)pCas9/gRNAl-XBPl+L189組。（XBP1/L189-DC)
[0096] S142 XBP1 基因敲除