[0097] (1 )DC培養第六天，按照下述表3中的體系制備質粒稀釋液。其中，表3中的組2所示 的pCas9/gRNAl-XBPl為上述實施例1制備的pCas9/gRNAl-XBPl質粒。
[0098] 表3
[0099]
[0100] (2)準備轉染試劑稀釋液:Polyfect-V轉染試劑4.8ul，Alys505培養基145.2ul。
[0101] (3)分別將質粒稀釋液50ul和轉染試劑稀釋液50ul充分混勻，室溫孵育15min。
[0102] (4)72小時后檢測二組DC細胞中XBP1基因的表達。
[0103] 實施例2
[0104]本發明實施例2提供了一種DC細胞XBP1基因敲除方法。該方法包括如下步驟：
[0105] S21.基因敲除靶點和寡核苷酸設計
[0106] 直接按照實施例1中S11進行處理。
[0107] S22.pCas9/gRNAl基因敲除載體連接和鑒定 [0108]直接按照實施例1中步驟S12進行處理。
[0109] S23.DC細胞培養
[0110]直接按照實施例1中步驟S13進行處理。
[0111] S24.DC細胞XBP1基因敲除
[0112] S241 DC的分組情況如下：
[0113] (1)陰性對照組；（NC-DC)
[0114] (3)pCas9/gRNAl-XBPl+L189組。（XBP1/L189-DC)
[0115] S242 XBP1 基因敲除
[0116] (1 )DC培養第六天，按照下述表4中的體系制備質粒稀釋液。其中，表4中的組3所示 的pCas9/gRNAl-XBPl為本實施例2步驟S22制備的pCas9/gRNAl-XBPl質粒。
[0117] 表4
[0118]
[0119] (2)準備轉染試劑稀釋液:Polyfect-V轉染試劑4.8ul，Alys505培養基145.2ul。
[0120] (3)分別將質粒稀釋液50ul和轉染試劑稀釋液50ul充分混勻，室溫孵育15min。
[0121] (4)將轉染液加入培養至第六天的DC細胞中，XBP1/L189-DC組中另外加入luM L189〇
[0122] (5)72小時后檢測二組DC細胞中XBP1基因的表達。
[0123] DC細胞內XBP1基因表達水平的檢測
[0124] 將上述實施例1、2中組1、組2和組3中的轉染后的DC分別進行XBP1基因表達水平的 檢測，具體方法如下：
[0125] (l)RNA 提取
[0126] 分別收集1 X 106個質粒轉染后的三組DC細胞，利用RNA提取試劑盒(Aurum Total RNA Mini Kit，BioRad，Cat.No.732-6820)提取出細胞內的總RNA。
[0127] (2)qRT_PCR 檢測 XBPl-mRNA 水平
[0128] 利用一步法qRT-PCR試劑盒（iScriptTMOne-StepRT-PCRKitWithSYBR Green，Bio-Rad，Cat. No. 170-8892)對提取出的總RNA進行XBP1基因表達水平檢測。
[0129] 反應體系如下表5所示：
[0130] 表5
[0131]
[0132] 反應條件如下表6所示：
[0133] 表6
[0134]
[0135] (3)XBP1基因敲除結果
[0136] 三組DC細胞中XBP1基因的表達水平如圖3所示，以NC-DC中XBP1表達量作為100%， pCas9/gRNAl-XBPl 質粒轉染組 XBP1-DC 的相對表達量為 18.59%，pCas9/gRNAl-XBPl 質粒轉 染+L189藥物處理組XBP1/L189-DC的相對表達量為0.89%。單純口〇389/^1?祖118?1質粒轉 染大概能敲除DC細胞內超過80%的XBP1基因。而加入L189處理后， PCas9/gRNAl-XBPl質粒 敲除XBP1基因的效率大概是不加 L189的XBP1-DC組的20.9倍。因此，1^189可大大提高 CRISPR/Cas9系統敲除XBP1基因的效率。
[0137] 實施例3
[0138] DC激發的T細胞抗腫瘤實驗
[0139] S31 DC-T 細胞培養
[0140] (1)將實施例1中步驟S13中培養DC細胞前的未貼壁細胞用含0.5%自體血漿的 Alys-505培養液調整細胞密度為1 X 106/ml，轉入六孔板中，2ml/孔，同時每孔添加1000U/ ml的IFN- γ，置于飽和濕度、37 °C、5.0 % C02培養箱中培養。
[0141] (2)24h后，每孔分別加入50ng/ml CD3單抗，1000U/ml IL-2，1000U/ml IL-la，置 于飽和濕度、37 °C、5.0 % C02培養箱中繼續培養。
[0142] (3)每3天調整細胞密度為lX106/ml，添加含1000U/ml IL-2和0.5%自體血漿的 Alys-505培養液。
[0143] (4)第9天將三種DC細胞(NC-DC、XBP1-DC(實施例2中轉染DC)、XBP1/L189-DC(實施 例3中轉染DC))分別與T細胞以1:10的比例混合，用含0.5 %自體血漿、1000U/ml IL-2、 100ng/ml GM-CSF的Alys-505培養液繼續培養至第14天，獲得三種成熟的DC-T細胞。
[0144] S32DC-T細胞抗腫瘤實驗
[0145] (1)以三種 DC-T 細胞（NC-DC-T、XBP1-DC-T、XBP1/L189-DC-T)作為效應細胞，CFSE 標記的視網膜母細胞瘤RB作為靶細胞，按照20:1的效靶比混合效應細胞和靶細胞，輕輕混 勻。
[0146] (2)5%⑶2，37°C培養箱孵育24h，反應結束后，加入lμg/ml PI染液，混勻，室溫避 光孵育15min后，利用流式細胞儀檢測CFSE+PI+細胞(死亡的RB細胞）的百分率。實驗結果 (圖4)表明，與對照組相比，DC細胞內XBP1基因的敲除效率越高，其誘導的DC-T細胞對RB腫 瘤細胞的殺傷效率越高，激發出更強的抗腫瘤免疫效應。
[0147]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種高效的DC細胞XBP1基因敲除方法，包括如下步驟： 以內質網壓力感受因子XBP1為靶基因進行CRISPR靶向序列設計，并根據所述CRISPR靶 向序列設計正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列； 將所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列進行退火反應處理形成雙鏈寡核苷酸； 酶切PCas9/gRNAl載體獲得線性化載體； 將所述雙鏈寡核苷酸與所述線性化載體在連接反應體系中進行連接反應處理，獲得連 接產物； 將所述連接產物轉化感受態細胞，并將被轉化后的細胞進行擴大培養后進行質粒提取 處理，獲得pCas9/gRNAl -XBP1質粒； 將所述pCas9/gRNAl-XBPl質粒對DC細胞進行轉染培養處理。2. 根據權利要求1所述的DC細胞XBP1基因敲除方法，其特征在于:所述轉染培養處理的 轉染培養體系中還加入L189。3. 根據權利要求2所述的DC細胞XBP1基因敲除方法，其特征在于:所述L189在所述轉染 培養體系中的濃度為〇. 1μΜ-10μΜ。4. 根據權利要求2或3所述的DC細胞ΧΒΡ1基因敲除方法，其特征在于：所述pCas9/ gRNA卜XBP1質粒的濃度為10-20μg/ml;所述DC細胞的濃度為2 X 105個/ml-2 X 106個/ml。5. 根據權利要求1-3任一所述的DC細胞XBP1基因敲除方法，其特征在于:所述CRISPR靶 向序列為 CCGCGCCGAACCCGGCCGA。6. 根據權利要求5所述的DC細胞XBP1基因敲除方法，其特征在于:所述正向寡核苷酸序 列為： 5 '-GAAACACCGCCGCGCCGAACCCGGCCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG TT-3,； 所述反向寡核苷酸序列為： 5 '-AACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCGGCCGGGTTCGGCGCGGCGGTGTT TC-3,。7. 根據權利要求1-3、6任一所述的DC細胞XBP1基因敲除方法，其特征在于:所述退火反 應處理中的退火反應體系包括所述正向寡核苷酸序列、所述反向寡核苷酸序列、NaCl和 Tris-Cl 試劑，且所述退火反應的程序為：90 °C4min，70°C lOmin，55°C lOmin，40°C lOmin，25 °C10min〇8. 根據權利要求1-3、6任一所述的DC細胞XBPl基因敲除方法，其特征在于:所述連接反 應體系包括所述雙鏈寡核苷酸、所述線性化載體、T4DNA連接酶、EcoRV、連接酶Buffer、 PEG4000試劑，且所述反應條件為：22 °C 30min，37 °C 15min。
【專利摘要】本發明提供了一種高效率的DC細胞XBP1基因敲除方法。本發明DC細胞XBP1基因敲除方法包括基因敲除靶點和寡核苷酸設計、寡核苷酸退火反應處理、酶切線性化載體、線性化載體與雙鏈寡核苷酸連接反應和轉化感受態細胞以及DC細胞XBP1基因敲除等步驟。本發明DC細胞XBP1基因敲除方法采用改良的CRISPR/pCas9基因敲除系統，以XBP1為靶基因進行CRISPR靶向序列設計并制備出pCas9/gRNA1-XBP1質粒，進一步在L189藥物的處理作用下使其對DC細胞進行轉染，從而能高效的敲除DC細胞內的XBP1基因，有效保證了DC細胞的免疫刺激作用，有效發揮了DC細胞抗腫瘤免疫作用。
【IPC分類】C12N5/0784, C12N15/85
【公開號】CN105602987
【申請號】CN201510814335
【發明人】不公告發明人
【申請人】深圳市默賽爾生物醫學科技發展有限公司
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年11月23日