通過用短雙歧桿菌探針和引物對包含非活的短雙歧桿菌的產品（即嬰兒配方） 進行5'核酸酶測定并將其與校準曲線進行比較來測定cfu的相當量(如WO 2005039319中所 公開地），所述校準曲線從已添加已知量干的、活的短雙歧桿菌cfu的可比產品（例如標準嬰 兒配方)獲得。所述干的、活的雙歧桿菌可如上所述購得。認為校準曲線中由活的短雙歧桿 菌(其與包含失活短雙歧桿菌的產品具有同樣的5'核酸酶測定應答)得到的cfu值是非活的 短雙歧桿菌的相當量。或者，每克干重的cfu量可以在失活步驟之前在組合物中測定。
[0027] 存在大量活的雙歧桿菌仍會導致液體嬰兒配方中發生后酸化作用。因此，本發明 的組合物包含每克組合物干重小于IO3Cfu活的雙歧桿菌，優選地小于10 2,更優選地小于 lOcfu。當采用液體形式時，本發明的組合物包含每100mL優選地小于IO4Cfu活的雙歧桿菌， 優選地小于l〇 3cfu，更優選地小于102cfu。活的雙歧桿菌的cfu可以如Ingham，S.C.，1999， J.Food Prot.62(1)77-80頁所述進行適當測定。優選地，所述組合物根本不包含可測量的 活的短雙歧桿菌cfu。然而，完全不存在活的短雙歧桿菌是難于測定的或者是不可能測定 的。適當地，可通過平板培養法測定的低于檢測限來表示不存在活的短雙歧桿菌。該檢測限 為每克干重組合物103cfu。
[0028] 本申請中非活的短雙歧桿菌涉及死的短雙歧桿菌、非可培養(non-culturable)的 短雙歧桿菌、不生長的短雙歧桿菌和/或(代謝)失活的短雙歧桿菌。可通過本領域已知的方 法使短雙歧桿菌細胞成為非活的細胞，包括熱處理步驟(包括滅菌、巴氏消毒、UHT處理）、輻 射(UV)、用氧處理、用殺菌劑(例如乙醇)處理、超聲處理、超高壓應用、高壓勾漿以及使用細 胞破碎儀。優選地，短雙歧桿菌被熱殺死。
[0029] 非活的短雙歧桿菌的存在有利地預防和/或治療至少一種選自以下的疾病:感染、 腹瀉、便秘、胃腸炎癥、由腸道成熟受損引起的疾病、（食物)過敏、特應性皮炎、濕疹和哮喘， 同時提供許多產品技術益處，包括延長貨架期、降低細菌污染發生率、減少產品的后酸化作 用、改善劑量控制以及改善重溶的方便性。
[0030] 非消化性寡糖
[0031 ]本發明的組合物包含非消化性寡糖A和/或B。所述非消化性寡糖A和/或B優選地刺 激腸內產乳酸細菌(特別是雙歧桿菌和/或乳桿菌）的生長，并因此刺激健康腸內微生物群 的形成，并優選發酵成有機酸。所形成的有機酸刺激粘液產生并因此進一步改善嬰兒中的 腸屏障功能和/或成熟。因此，非消化性寡糖A和/或B的存在對感染、過敏和/或特應性疾病 具有有利的作用。有利地，所述非消化性寡糖A和/或B是水溶性的（根據L. Prosky等， J.Assoc.Anal.Chem 71:1017-1023,1988中公開的方法）并且是聚合度（degree of po lymeri sat ion, DP)為2~200的寡糖。所述非消化性寡糖A和/或B的（平均）DP優選低于 200，更優選低于100，更優選低于60，最優選低于40。所述非消化性寡糖A和/或B不在腸中被 人類上消化道(小腸和胃）中存在的消化酶所消化。所述非消化性寡糖A和/或B優選被人類 腸內微生物群所發酵。例如，認為葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和麥芽糊精是可 消化的。寡糖原材料可包含單糖例如葡萄糖、果糖、巖藻糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、葡糖醛 酸、乙酰氨基半乳糖(GalNac)等，但這些不是本發明中所述寡糖的一部分。
[0032] 本發明的組合物、方法和用途中涉及的非消化性寡糖A和/或B包括非消化性寡糖 的混合物。這是常用的實踐，因為使用例如一種鏈長的非消化性寡糖是非常昂貴的。優選 地，所述非消化性寡糖選自：低聚果糖(包括菊粉）、非消化性糊精、低聚半乳糖(包括反式低 聚半乳糖）、低聚木糖、低聚阿拉伯糖、低聚阿拉伯半乳聚糖、低聚葡萄糖(包括低聚龍膽糖 和環糊精）、低聚葡甘露聚糖、低聚半乳甘露聚糖、低聚甘露聚糖、低聚殼糖、糖醛酸低聚糖、 唾液酸低聚糖（包括3-SL、6-SL、LSTa，b，c、DSLNT、S-LNH、DS-LNH)和低聚巖藻糖（包括（未 經)硫酸化的巖藻多糖〇3、241^、341^即？1，11，111，￥、^^^1、1^)!〇及其混合物，更優選 低聚果糖(包括菊粉）、低聚半乳糖(包括反式低聚半乳糖，α以及優選地β連接的）、糖醛酸低 聚糖和低聚巖藻糖及其混合物，更優選反式低聚半乳糖和/或菊粉，最優選反式低聚半乳 糖。當非消化性寡糖A和/或B是混合物時，使用各參數的平均數來限定本發明。
[0033] 本發明優選地提供包含兩種不同的非消化性寡糖（即非消化性寡糖A和非消化性 寡糖Β)的組合物。所述非消化性寡糖A和非消化性寡糖B優選地具有不同類型的糖苷鍵、不 同的聚合度和/或不同的單糖組成。
[0034] 根據本發明的一個優選實施方案，特定單糖在非消化性寡糖A中的百分比比同種 單糖在非消化性寡糖B中的百分比至少高出40% (數目），優選地至少50%，更優選地至少 75%，更優選地至少90%。增加單糖的多樣性刺激更廣泛的有益腸細菌群。單糖在非消化性 寡糖中的百分比可簡單地如下計算:將非消化性寡糖中的各單糖單元(例如葡萄糖)數除以 該非消化性寡糖中的單糖單元總數，再乘以100。當非消化性寡糖是非消化性寡糖混合物 時，須將非消化性寡糖混合物中每個單獨單糖單元的貢獻考慮在內。非消化性寡糖混合物 中的單糖百分比可簡單地如下測定:將該混合物完全水解并測定每種單糖數目的百分比。 優選地，非消化性寡糖A包含至少40% (數目）半乳糖，更優選地至少67%半乳糖，更優選地 至少75%半乳糖。優選地，非消化性寡糖B包含至少30% (數目）果糖，更優選地至少67%果 糖，更優選地至少80 %果糖。
[0035]根據本發明的一個優選實施方案，非消化性寡糖A的平均DP比非消化性寡糖B的平 均DP至少低5個單糖單元，優選地至少10個，更優選地至少15個。優選地，非消化性寡糖A的 平均DP為2~10，更優選為3-5。優選地，非消化性寡糖B的平均DP低于200，更優選11~60，更 優選20~30。包含聚合度增加的非消化性寡糖降低了滲透負荷，這對嬰兒營養物有利和/或 增強腸內微生物群在結腸更遠處的益生元刺激。具有不同DP的非消化性寡糖A和B可具有相 同或不同的單糖組成。優選地，非消化性寡糖A和B具有不同的單糖組成和不同的DP。
[0036]優選地，非消化性寡糖A和B的累積重量的至少80wt.%、更優選至少95wt.%、最優 選至少98wt. %具有低于60、更優選地低于40、最優選地低于20的DP。較低的DP有利地降低 粘度以及提高非消化性寡糖的發酵性能。優選地，非消化性寡糖A和B的累積重量的至少 50wt. %、優選至少75wt. %是DP為2~8的非消化性寡糖。通過使用包含高重量百分比的小 的非消化性寡糖的混合物，提高了發酵性能以及對乳酸細菌和雙歧桿菌的生長的刺激作 用。
[0037]在本發明的另一優選實施方案中，非消化性寡糖A的至少一種糖苷連接相對于非 消化性寡糖A總糖苷連接的百分比與寡糖B中同種糖苷連接的百分比相比至少高出40 %或 低出40%，優選地至少50%，更優選地至少75%。本發明中使用的術語"糖苷連接"是指通過 脫水在兩個環狀單糖的環之間形成的C-O-C連接。糖苷連接的多樣性增加刺激了更廣泛的 有益細菌。糖苷連接的不同在于它們與單糖單元中不同編號位置的碳原子共價結合，和/或 它們形成α或β鍵。非消化性糖類中存在的不同糖苷連接的實例有:β(1，3)、α(1，4)、β(2，1)、 α(1，2)和β(1，4)連接。優選地，在非消化性寡糖A中的糖苷連接包含至少40% (更優選至少 75%)的0(1，4)和/或扒1，6)糖苷連接。在非消化性寡糖8中的糖苷連接優選地包含至少 40% (更優選至少75% )的β(2,1)糖苷連接。優選地，非消化性寡糖A和B在單糖單元組成和 糖苷連接類型上不同。優選地，非消化性寡糖A和B在糖苷連接類型和DP上不同。最優選地， 非消化性寡糖A和B在糖苷連接類型、單糖組成和DP上不同，從而最佳地改善生物多樣性以 及刺激多種腸內生物(尤其是雙歧桿菌屬的不同菌種)的生長。
[0038] 優選地，非消化性寡糖A和B總單糖單元的至少60%、更優選至少75%、更優選 90 %、最優選98 %是選自半乳糖(gal)、果糖(fru)和葡萄糖(glu)單糖的單糖。
[0039]非消化性寡糖A優選為選自β-低聚半乳糖、α-低聚半乳糖和半乳聚糖的寡糖。根據 一個更優選的實施方案，非消化性寡糖A是β_低聚半乳糖或反式低聚半乳糖。優選地，非消 化性寡糖A包含帶有β(1，4)和/或β(1，6)糖苷鍵的低聚半乳糖以及末端葡萄糖。反式低聚半 乳糖例如可以商品名 Vivinal?GOS(Bo;rculo Domo Ingredients ,Zwolle ,Netherlands)、 Bi2muno(Clasado)、Cup-〇Iigo(Nissin Sugar)和01 igomate55(Yakult)購得。
[0040] 非消化性寡糖B優選為低聚果糖。低聚果糖在其它語境中可以有如下名稱： fructopolysaccharide、〇1 igofructo se、po Iy fructos