靈芝氨基酸提取物及其制備方法與用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種靈芝氨基酸提取物及其制備方法，所述靈芝氨基酸提取物可應用 于制備降血糖和抗氧化相關保健品及藥品。 (二)
【背景技術】
[0002] 靈芝(Ganoderma Lucidum Karst)為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實體，是 我國傳統的藥用真菌，據《神農本草經》記載，靈芝具有補中益氣、滋補強壯、扶正固本、延年 益壽等功效，而在《本草綱目》中靈芝亦被列為上品，2000年版《中國藥典》中首次承認靈芝 的藥用價值，作為我國法定中藥材。現代醫學證明，靈芝含有多種生理活性物質，包括多糖 類、三萜類、留醇類、生物堿類、呋喃衍生物、氨基多肽類、無機元素、脂肪酸等。靈芝能夠調 節、增強人體免疫力，對神經衰弱、風濕性關節炎、冠心病、高血壓、肝炎、糖尿病、腫瘤等有 良好的協同治療作用。我國消費者普遍相信靈芝類保健品有抗癌、降糖、提高免疫力等功 效，2014年全國靈芝類保健產品總銷售額約20億元人民幣，發展勢頭較好。
[0003] 靈芝中含有18種氨基酸，其中人體必需氨基酸的相對含量高于50%，比一般食用 菌高40%。相關文獻報道了泰山地區的五種靈芝成品的氨基酸含量，除色氨酸被水解破壞 而未檢出外，其它17種氨基酸含量豐富，其氨基酸的總含量最高為12.87%，并含有7種人體 必需氨基酸，值得深度開發利用。氨基酸是生物體內構成蛋白質分子的基本單位，與生物的 生命活動有著密切的關系，是生物體內不可缺少的營養成分之一。人體缺乏任何一種必需 氨基酸，就可導致生理功能異常，影響抗體代謝的正常進行，最后導致疾病。同樣，如果人體 內缺乏某些非必需氨基酸，會產生抗體代謝障礙。例如精氨酸和瓜氨酸對形成尿素十分重 要;胱氨酸攝入不足會引起胰島素減少，血糖升高。目前關于靈芝化學成分分析的研究報道 偏重于多糖及三萜類成分，對靈芝氨基酸及其提取分離的研究報道較少。
[0004] 靈芝化學成分復雜，提取靈芝氨基酸需要優化的條件比較多，所以本發明選擇響 應面法。響應面法利用合理的試驗設計方法，并通過試驗得到一定的數據，采用多元二次回 歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析尋求最優工藝參數，是 解決多變量問題的一種統計方法。響應面的主要優勢在于可以減少試驗次數，評價多個參 數間的相互作用關系。
[0005] 本發明以靈芝為原料，用鹽酸水解法提取靈芝氨基酸，并通過響應面法優化提取 靈芝氨基酸的液料比、提取時間以及鹽酸濃度的工藝，并通過活性炭脫色、乙醇沉淀、離心 烘干得到純化的靈芝氨基酸提取物，為靈芝氨基酸的工業化生產提供價值指導。本發明同 時還發現該靈芝氨基酸提取物具有降糖和抗氧化能力，為靈芝氨基酸在保健品和藥品方面 的應用提供科學依據。 (三)
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種靈芝氨基酸提取物及其制備方法，所述的靈芝氨基酸提取物具 有降血糖和抗氧化能力，可應用于制備降血糖和抗氧化相關保健品及藥品。
[0007]本發明通過響應面法優化提取靈芝氨基酸的方法，利用design expert軟件，根據 Box-Behnken設計原則對液料比、提取時間以及鹽酸濃度這些影響靈芝氨基酸提取的因素 進行優化，從而提高靈芝氨基酸的提取率，縮短提取時間，降低能耗和產品成本。
[0008] 本發明采用如下技術方案：
[0009] -種靈芝氨基酸提取物，所述的靈芝氨基酸提取物按如下方法制備得到：
[0010] (1)酸水解：取靈芝粉末，按液料比為10~30:l(mL/g)加入4~10m〇l/L鹽酸溶液 中，加熱回流4~12h，抽濾得水解液，將所得水解液減壓蒸干，剩余物加水溶解，并調節pH至 2~4，得粗提液；
[0011] (2)提純：向步驟（1)所得粗提液中加入活性炭，在50~90°C下脫色15~55min，抽 濾除去活性炭，將濾液減壓濃縮后加入無水乙醇，調節pH至2~4,于2~6°C靜置20~24h，之 后在2000~3000r/min的轉速下離心分離10~15min，除去上層清液，收集固體沉淀，于50~ 70°C烘箱內恒溫干燥至恒重，得到所述的靈芝氨基酸提取物。
[0012]本發明通過響應面法優化提取靈芝氨基酸的方法，利用design expert軟件，根據 Box-Behnken設計原則對液料比、提取時間以及鹽酸濃度這些影響靈芝氨基酸提取的因素 進行優化，得出所述步驟(1)中，酸水解的最優條件為:液料比為20:1 (mL/g)，鹽酸溶液濃度 為7. Omo 1/L，加熱回流時間為9.5h。
[0013] 步驟（1)中，所述的靈芝粉末是將靈芝置于60~80°C下烘干至恒重，粉碎至5~10 目獲得。
[0014] 步驟(1)中，所述加熱回流的溫度通常為100~IHTC。
[0015] 步驟(1)中，推薦所述的剩余物加6~9質量倍的水溶解。
[0016] 步驟(2)中，推薦所述活性炭的質量用量為步驟（1)中所述靈芝粉末質量的5%~ 25%，優選15%。所述活性炭脫色的最優條件為:在80°C下脫色45min。
[0017] 步驟(2)中，推薦所述濾液減壓濃縮至初始體積的1/6~1/10,可觀察到有晶體析 出。推薦在濃縮后的濾液中加入1~3倍體積量的無水乙醇，優選2倍。
[0018] 步驟(1)或步驟(2)中，pH的調節通常使用氫氧化鈉和/或鹽酸，優選調節pH至3。
[0019] 本發明以PNPG為底物，以96孔板為反應載體，測定所述的靈芝氨基酸提取物對Ct-葡萄糖苷酶的抑制率，實驗證明，本發明靈芝氨基酸提取物在制備降血糖保健品及藥品方 面具有應用前景。
[0020] 本發明以DPPH為底物，以96孔板為反應載體，測定所述的靈芝氨基酸提取物對 DPPH自由基的清除能力及添加靈芝氨基酸提取物后DPPH自由基的殘留率，實驗證明，本發 明靈芝氨基酸提取物在制備抗氧化保健品及藥品方面同樣具有應用前景。
[0021] 本發明突出的有益效果和優點在于：
[0022] 1、本發明采用的Box-Behnken(BBD)中心組合設計模型是響應面法，與正交法相比 該方法可以減少試驗次數，同時評價多個參數間的相互作用關系;通過響應面法得到最優 提取條件:液料比為20:1，提取時間為9.5h，鹽酸濃度7.0m 〇L/L;最終所得純化的靈芝氨基 酸提取物其氨基酸含量高達17.78% ;
[0023] 2、本發明首次公開靈芝氨基酸的提取工藝，且所得靈芝氨基酸提取物可應用于制 備降血糖及抗氧化的保健品和藥品等;本發明工藝流程短，方法簡單，操作便捷，具有較好 的經濟效益和社會效益，為靈芝氨基酸的保健品和藥品的開發提供了一定的理論和實踐依 據。 (四）
【附圖說明】
[0024] 圖Ia為實施例1中茚三酮比色法測定氨基酸含量的標準曲線圖；
[0025] 圖Ib為實施例1中液料比對靈芝氨基酸得率的影響圖；
[0026] 圖Ic為實施例1中提取時間對靈芝氨基酸得率的影響圖；
[0027] 圖Id為實施例1中鹽酸濃度對靈芝氨基酸得率的影響圖；
[0028]圖2a為實施例1中液料比與提取時間對靈芝氨基酸提取得率影響的響應面三維 圖；
[0029]圖2b為實施例1中液料比與鹽酸濃度對靈芝氨基酸提取得率影響的響應面三維 圖；
[0030] 圖2c為實施例1中提取時間與鹽酸濃度對靈芝氨基酸提取得率影響的響應面三維 圖；
[0031] 圖3a為實施例5中靈芝氨基酸提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率圖；
[0032]圖3b為實施例5中阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率圖；
[0033]圖4a為實施例5中靈芝氨基酸提取物對DPPH自由基的清除能力圖；
[0034]圖4b為實施例5中維生素C對DPPH自由基的清除能力圖；
[0035]圖5a為實施例5中不同濃度的靈芝氨基酸提取物清除DPPH自由基曲線圖；
[0036]圖5b為實施例5中不同濃度的維生素C清除DPPH自由基曲線圖。 (五)
【具體實施方式】
[0037] 下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并不僅限于 此。
[0038] 實施例1
[0039] 靈芝氨基酸最優提取條件的確定
[0040] -種響應面法優化提取靈芝氨基酸的方法，利用design expert軟件，根據Box-Behnken設計原則對液料比、提取時間以及鹽酸濃度這些影響靈芝氨基酸提取的因素進行 優化，該方法包括以下步驟：
[0041](一)樣品準備
[0042] (1)預處理:將靈芝80.0 g置于60~80 °C下烘干至恒重，粉碎，得靈芝粉末76.4g;
[0043] (2)酸水解：取步驟（1)所得靈芝粉末2.0g，按液料比為10~30 : l(mL/g)加入4~ IOmo 1/L的鹽酸溶液中，加熱回流4~12h，抽濾，得氨基酸粗提取液；
[0044] (3)調pH:用氫氧化鈉溶液調節步驟(2)所得的氨基酸粗提取液的pH至3;