[0045] (4)定容:將步驟(3)所得的氨基酸粗提取液定容至50mL，得到靈芝氨基酸樣品液 備用。
[0046](二)茚三酮比色法測定靈芝氨基酸含量 [0047] (1)氨基酸標準曲線的制備
[0048]分別量取 0yL、100yL、150yL、200yL、250yL、300yL、350yL、400yL、450yL、500yL 的甘 氨酸溶液于試管中，用磷酸鹽緩沖液補至體積為1500yL，分別加入ImL茚三酮溶液，震蕩， 100<€下反應15111；[11，常溫下冷卻10111；[11，用50%乙醇定容至10111]^，57〇111]1波長下檢測吸光度 (X)，每個組設置三個平行組。以吸光度(X)為橫坐標，氨基酸重量(Y)為縱坐標，繪制氨基酸 標準曲線，茚三酮比色法測定氨基酸含量的標準曲線見圖la。其線性回歸方程為Y = 0. 1201X+0.0209，R2 = 0.9989。
[0049] (2)靈芝氨基酸的含量測定
[0050]分別取一定濃度的靈芝氨基酸樣品液IOOyL于試管中，用磷酸鹽緩沖液補至體積 為1500yL，分別加入ImL茚三酮溶液，震蕩，100°C下反應15min，常溫下冷卻lOmin，用50%乙 醇定容至10mL，570nm波長下檢測吸光度，每個組設置三個平行組。通過氨基酸標準曲線計 算樣品液中氨基酸的含量。靈芝氨基酸得率=氨基酸含量/靈芝重量X 100%。
[0051] (三)試驗設計與統計分析
[0052] 1、單因素試驗
[0053] 改變液料比、提取時間以及鹽酸濃度這些影響靈芝氨基酸提取的因素進行單因素 試驗。
[0054] (1)液料比的變化對靈芝氨基酸提取得率的影響：
[0055]在提取溫度100°C，提取時間8h，鹽酸濃度為6m〇L/L的條件下，將液料比設定為10: 1、 15:1、20:1、25:1、30:1的五個變化值。液料比的變化對靈芝氨基酸提取得率的影響結果 如圖Ib所示。
[0056]經檢測，當液料比為15:1時，靈芝氨基酸得率為4.417%，隨著料液比的增加，氨基 酸得率反而下降，因此，料液比取15:1較為合適。
[0057] (2)提取時間對靈芝氨基酸提取得率的影響：
[0058]在提取溫度100°C，液料比為15 :1，鹽酸濃度為6m〇L/L的條件下，將提取時間設定 為4h、8h、12h、16h、20h五個變化值。提取時間對靈芝氨基酸提取得率的影響結果如圖I c所 不。
[0059]經檢測，當提取時間為8h時，靈芝氨基酸得率為4.324%，隨著提取時間的增加，氨 基酸得率反而下降，因此，提取時間取8h較為合適。
[0060] (3)鹽酸濃度對靈芝氨基酸提取得率的影響：
[00611在提取溫度IOO °C，液料比為15:1，提取時間8h的條件下，將鹽酸濃度設定為2m0L/ L、4moL/L、6moL/L、8moL/L、10moL/L五個變化值。鹽酸濃度對靈芝氨基酸提取得率的影響結 果如圖Id所示。
[0062]經檢測，當鹽酸濃度為6m〇L/L時，靈芝氨基酸得率為4.384%，隨著鹽酸濃度的增 加，氨基酸得率反而下降，因此，鹽酸濃度取6m〇L/L較為合適。
[0063] 2、相響應面法優化提取靈芝氨基酸的方法
[0064] (1)響應面法設計優化
[0065]根據單因素試驗結果，選取對靈芝氨基酸提取影響較為顯著的液料比、提取時間 以及鹽酸濃度這三個因素，利用design expert軟件，根據Box-Behnken設計原則設計試驗， 每個因素設計三個水平，設定結果見表1。
[0066] 表1:響應面分析因素及水平表
[0069] 按照響應面分析因素及水平表，以液料比(A)、提取時間(B)以及鹽酸濃度(C)為自 變量，以靈芝氨基酸得率為響應值(Y)，響應面試驗方案及響應值見表2。
[0070] 表2:響應面試驗方案及響應值
[0072] (2)模型的建立和統計分析
[0073] 根據所得數據進行二次多元回歸分析，得到相應變量(液料比A、提取時間B以及鹽 酸濃度C)與響應值(氨基酸得率Y)之間的多元二次回歸方程。
[0074] 多元二次回歸方程：Y= -4 · 62331+0 · 51495A+0 · 48688B+0 · 73299C - 2 · 71750 X 10-3AB+0.013705AB+6.80938 X 10-3BC-0.016624A2 -0.025543B2 -0.076071C2
[0075] 對二次多元回歸方程各項進行方差分析及顯著性檢驗結果見表3。結果表明，該回 歸模型的顯著性檢驗P〈〇.0001，表明該模型具有統計學意義，回歸模型的校正系數R 2 = 0.9743，變異系數C. V. % = 3.2 %，失擬項P = 0.073>0.005，失擬性檢驗結果不顯著，說明該 模型與數據擬合程度較高，實驗誤差小，可以用該模型分析和預測鹽酸水解法提取靈芝氨 基酸的結果。
[0076]表3:方差分析及顯著性檢驗結果
[0079] (3)試驗結果分析與優化
[0080]利用Design Expert軟件，根據回歸方程進行繪圖分析，得到回歸方程的響應面三 維圖。液料比、提取時間、鹽酸濃度對靈芝氨基酸得率影響的響應面三維圖如圖2a~2c所 不。
[0081 ]由Design Expert軟件得到的鹽酸水解法提取靈芝氨基酸的最佳提取條件為:液 料比為20 : 1，提取時間為9.41h，鹽酸濃度7.04m〇L/L，在此條件下靈芝氨基酸得率為 4.60%。為了操作的簡便性，實際操作的最優條件為:液料比為20:1，提取時間為9.5h，鹽酸 濃度7.0m 〇L/L，在此條件下靈芝氨基酸得率為4.78%。
[0082] 實施例2
[0083]靈芝氨基酸提取物的制備及其氨基酸含量測定：
[0084] (1)預處理:將靈芝40g置于70°C下烘干至恒重，粉碎，得靈芝粉末38.3g;
[0085] (2)酸水解:取步驟（1)所得靈芝粉末30 ·0g，按液料比為20:1 (mL/g)加入600mL濃 度為7.0m〇L/L的鹽酸溶液中，在100°C下加熱回流9.5h，抽濾得水解液，將所得水解液減壓 蒸干，加水15mL溶解濃縮產物，并用氫氧化鈉調節pH至3，得粗提液；
[0086] (3)提純：向步驟(2)所得粗提液中加入4.5g活性炭(活性炭的添加量是靈芝粉末 質量的15%)，在80°C下脫色45min，抽濾除去活性炭，取濾液減壓濃縮至初始體積的1/8,有 晶體析出，加入2倍體積量無水乙醇，用氫氧化鈉和鹽酸調節pH至3,4°C靜置22h，之后在 3000r/min的轉速下離心分離15min，除去上層清液，收集沉淀，于50°C烘箱內恒溫干燥至恒 重，得到純化的靈芝氨基酸提取物1.6818g;
[0087] (4)氨基酸含量測定：將步驟（3)所得純化的靈芝氨基提取物配成4mg/mL的樣品 液，通過茚三酮比色法測定氨基酸含量，計算靈芝氨基酸含量。靈芝氨基酸含量=氨基酸含 量/靈芝氨基酸提取物重量X100%。
[0088] 經檢測，本實施例所提取的純化的靈芝氨基酸提取物的靈芝氨基酸含量為 17.78%〇
[0089] 實施例3
[0090] 靈芝氨基酸提取物的制備及其氨基酸含量測定：
[0091] (1)預處理:將靈芝40.0 g置于60°C下烘干至恒重，粉碎，得靈芝粉末38.2g;
[0092] (2)酸水解:取步驟（1)所得靈芝粉末30.0 g，按液料比為10:1 (mL/g)加入300mL濃 度為4.0m〇L/L的鹽酸溶液中，在HKTC下加熱回流4h，抽濾得水解液，將所得水解液減壓蒸 干，加水15mL溶解濃縮產物，并用氫氧化鈉調節pH至3，得粗提液；
[0093] (3)提純：向步驟(2)所得粗提液中加入1.5g活性炭(活性炭的添加量是靈芝粉末 質量的5%)，在50°C下脫色55min，抽濾除去活性炭，取濾液減壓濃縮至初始體積的1/6,有 晶體析出，加入1倍體積量無水乙醇，用氫氧化鈉和鹽酸調節pH至3,2 °C靜置20h，之后在 3000r/min的轉速下離心分離IOmin，除去上層清液，收集沉淀，于60 °C烘箱內恒溫干燥至恒 重，得到純化的靈芝氨基酸提取物1.3687g;
[0094] (4)氨基酸含量測定：將步驟（3)所得純化的靈芝氨基提取物配成4mg/mL的樣品 液，通過茚三酮比色法測定氨基酸含量，計算靈芝氨基酸含量。靈芝氨基酸含量=氨基酸含 量/靈芝氨基酸提取物重量X100%。
[0095] 經檢測，本實施例所提取的純化的靈芝氨基酸提取物的靈芝氨基酸含量為 14.75%〇
[0096] 實施例4
[0097] 靈芝氨基酸提取物的制備及其氨基酸含量測定：
[0098] (1)預處理:將靈芝40.0 g置于60°C下烘干至恒重，粉碎，得靈芝粉末38.5g;
[0099] (2)酸水解:取步驟（1)所