得靈芝粉末30.0 g，按液料比為30:1 (mL/g)加入900mL濃 度為IOmoL/L的鹽酸溶液中，在100°C下加熱回12h，抽濾得水解液，將所得水解液減壓蒸干， 加水15mL溶解濃縮產物，并用氫氧化鈉調節pH至3，得粗提液；
[0100] (3)提純：向步驟(2)所得粗提液中加入1.5g活性炭(活性炭的添加量是靈芝粉末 質量的5%)，在90°C下脫色15min，抽濾除去活性炭，取濾液減壓濃縮至初始體積的1/10,有 晶體析出，加入3倍體積量無水乙醇，用氫氧化鈉和鹽酸調節pH至3,6 °C靜置24h，之后在 3000r/min的轉速下離心分離15min，除去上層清液，收集沉淀，于70°C烘箱內恒溫干燥至恒 重，得到純化的靈芝氨基酸提取物1.4881g;
[0101] (4)氨基酸含量測定：將步驟（3)所得純化的靈芝氨基提取物配成4mg/mL的樣品 液，通過茚三酮比色法測定氨基酸含量，計算靈芝氨基酸含量。靈芝氨基酸含量=氨基酸含 量/靈芝氨基酸提取物重量X100%。
[0102] 經檢測，本實施例所提取的純化的靈芝氨基酸提取物的靈芝氨基酸含量為 15.44%〇
[0103] 實施例5
[0104] 靈芝氨基酸提取物的降糖活性和抗氧化活性的考察（以實施例2制得的靈芝氨基 酸提取物為測試樣品）：
[0105] 為考察本發明的靈芝氨基酸提取物的降糖活性和抗氧化活性，現進行以下實驗：
[0106] 1、靈芝氨基酸提取物的降糖活性測定：
[0107] 以PNPG為底物，以96孔板為反應載體，測定靈芝氨基酸提取物對α-葡萄糖苷酶的 抑制率。
[0108] 標準反應體系:將40yL-定濃度的靈芝氨基酸提取物溶液加入20yL 0.2U/mL的α-葡糖糖苷酶溶液中，于37°(：下反應1〇1^11，加入2(^1^6.5111111〇1/1?即6溶液，于37°(：下反應 30min，用120yL 0.2mol/L Na2CO3溶液終止反應，用酶標儀在405nm波長處測定溶液的吸收 值，每個組設置三個平行組。氨基酸濃度對α-葡萄糖苷酶的抑制率關系見表4。實驗組靈芝 氨基酸提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制率見圖3a;陽性對照組阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑 制率見圖3b。
[0109] 樣品對酶活性的抑制率（％ ): Inhibition rate( % ) = [ (At)Biank - ABiank) -（Ao - A) ]/(AoBlank - ABlank)
[0110] AoBiank為只加入α-葡糖糖苷酶溶液和PNPG溶液的吸收值;ABiank為只加 PNPG溶液的 吸收值;Ao為加入待測樣品溶液，α-葡糖糖苷酶溶液和PNPG溶液的吸收值;A為只加待測樣 品溶液和PNPG溶液的吸收值。
[0111]表4:氨基酸濃度對α-葡萄糖苷酶的抑制率關系
[0113]由上表可知靈芝氨基酸提取物對α-葡糖糖苷酶具有一定的抑制作用，其IC50值為 380.62mg/L〇
[0114] 2、靈芝氨基酸提取物的抗氧化活性測定：
[0115] (1)靈芝氨基酸提取物對DPPH自由基的清除能力
[0116] 以DPPH為底物，以96孔板為反應載體，測定靈芝氨基酸提取物對DPPH自由基的清 除能力。
[0117] 取一定濃度的靈芝氨基酸提取物的溶液0yL、10yL、20yL、30yL、40yL、50yL、60yL、 70yL于96孔板中，無水乙醇補至體積70yL，加 DPPH溶液150yL，以乙醇替代DPPH溶液為空白 對照。充分混合，靜置30分鐘后，用酶標儀在516nm處測A值，每個組設置三個平行組。氨基酸 濃度與DPPH自由基的清除率關系見表5。實驗組靈芝氨基酸提取物對DPPH自由基的清除能 力見圖4a;陽性對照組維生素 C對DPPH自由基的清除能力見圖4b。
[0118] 自由基清除率的計算公式:清除率=(A0-A)/A0X100%
[0119] 表5:氨基酸濃度與DPPH自由基的清除率關系
[0121] 由上表可知靈芝氨基酸提取物對DPPH具有一定的清除作用，其IC50值為484.54μ g/mL〇
[0122] (2)DPPH的標準曲線的制備
[0123] 取DPPH溶液〇1^、4〇1^、8〇1^、120此、16〇1^、20〇1^于96孔板中，無水乙醇補至體積 200uL，充分混合，用酶標儀在516nm處測吸光度，每個組設置三個平行組。以吸光度(Y)為縱 坐標，以DPPH質量濃度ug/mL(X)為橫縱標制作DPPH標準曲線，其線性回歸方程為Y = 0.0192X-0.023，R2 = 0.9941。
[0124] (3)添加靈芝氨基酸提取物后DPPH自由基的殘留率
[0125] 以乙醇為溶劑，配制不同濃度的靈芝氨基酸提取物樣品液，分別取各不同濃度樣 品液40uL于96孔板中，無水乙醇補至體積70uL，加 DPPH溶液150uL，以乙醇替代DPPH溶液為 空白對照。充分混合，快速用酶標儀在516nm處測定其不同時間的吸光度值。根據標準曲線 換算成[DPPH·]的質量濃度，從而計算出[DPPH·]殘留率。根據[DPPH·]殘留率和相應的氨基 酸濃度，繪制出靈芝氨基酸[DPPH·]自由基殘留曲線圖。實驗組不同濃度的靈芝氨基酸提取 物清除DPPH自由基曲線見圖5a;陽性對照組不同濃度的維生素 C清除DPPH自由基曲線見圖 5b 〇
[0126] [DPPH·]殘留率的計算公式：[DPPH· ]rem= [DPPH· ]T/[DPPH· ]τ=〇 X 100%
[0127] 其中[DPPH· ]T為自由基清除過程中某一時刻[DPPH·]的質量濃度，[DPPH· ]τ=ο為 [DPPH·]的原始濃度。
[0128] 由圖5a可知靈芝氨基酸提取物對DPPH自由基清除能力與靈芝氨基酸提取物的濃 度呈正相關。
【主權項】
1. 一種靈芝氨基酸提取物，其特征在于，所述的靈芝氨基酸提取物按如下方法制備得 到： (1) 酸水解:取靈芝粉末加入鹽酸溶液中，加熱回流4~12h，抽濾得水解液，將所得水解 液減壓蒸干，剩余物加水溶解，并調節pH至2~4,得粗提液；所述鹽酸溶液的濃度為4~ 10m 〇l/L;所述鹽酸溶液的體積用量為10~30mL/lg靈芝粉末； (2) 提純：向步驟（1)所得粗提液中加入活性炭，在50~90°C下脫色15~55min，抽濾除 去活性炭，將濾液減壓濃縮后加入無水乙醇，調節pH至2~4，于2~6 °C靜置20~24h，之后在 2000~3000r/min的轉速下離心分離10~15min，除去上層清液，收集固體沉淀，于50~70°C 烘箱內恒溫干燥至恒重，得到所述的靈芝氨基酸提取物。2. 如權利要求1所述的靈芝氨基酸提取物，其特征在于，所述的靈芝粉末是將靈芝置于 60~80°C下烘干至恒重，粉碎至5~10目獲得。3. 如權利要求1所述的靈芝氨基酸提取物，其特征在于，步驟（1)中，所述鹽酸溶液的濃 度為7.0mol/L，所述鹽酸溶液的體積用量為20mL/lg靈芝粉末。4. 如權利要求1所述的靈芝氨基酸提取物，其特征在于，步驟（1)中，所述加熱回流的時 間為9.5h。5. 如權利要求1所述的靈芝氨基酸提取物，其特征在于，步驟（1)中，所述的剩余物加6 ~9質量倍的水溶解。6. 如權利要求1所述的靈芝氨基酸提取物，其特征在于，步驟(2)中，所述活性炭的質量 用量為步驟(1)中所述靈芝粉末質量的5%~25%。7. 如權利要求1所述的靈芝氨基酸提取物，其特征在于，步驟(2)中，所述濾液減壓濃縮 至初始體積的1 /6~1 /10。8. 如權利要求1所述的靈芝氨基酸提取物，其特征在于，步驟(2)中，在濃縮后的濾液中 加入1~3倍體積量的無水乙醇。9. 如權利要求1所述的靈芝氨基酸提取物，其特征在于，步驟（1)或步驟(2)中，pH的調 節使用氫氧化鈉和/或鹽酸。10. -種如權利要求1所述的靈芝氨基酸提取物在制備降血糖、抗氧化的保健品及藥品 中的應用。
【專利摘要】本發明提供了一種靈芝氨基酸提取物，其按如下方法制備得到：取靈芝粉末，按液料比為10～30：1加入4～10mol/L鹽酸溶液中，加熱回流4～12h，抽濾得水解液，將其減壓蒸干，剩余物加水溶解，并調節pH至2～4，得粗提液；粗提液用活性炭脫色后，濾除活性炭，將濾液減壓濃縮后加入無水乙醇，調節pH至2～4，靜置后離心分離，收集固體沉淀，干燥至恒重，得到所述的靈芝氨基酸提取物；本發明首次公開靈芝氨基酸的提取工藝，且所得靈芝氨基酸提取物可應用于制備降血糖及抗氧化的保健品和藥品等；本發明工藝流程短，方法簡單，操作便捷，具有較好的經濟效益和社會效益。
【IPC分類】A23L33/175, A61P3/10, A23L33/105, A61K36/074, A61P39/06
【公開號】CN105641001
【申請號】
【發明人】張慧, 姜慧潔, 張曉靜, 顏繼忠
【申請人】浙江工業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月21日