10:25,反應溫度為60,反應時間為36h的條件下，收率為97.8%， 收率最高，并且改變上述任何一個條件都會對收率產生巨大影響。
[0088] 實施例21
[0089] 具體工藝條件與實施例11相同，不同之處再與考察不同取代基，具體取代基見表 6,所得4-氨基甲酸酯-3-甲氧基肉桂酸胺烷基酰胺類化合物，其化學結構均經 1H-NMR，13C_ NMR 和 ESI-MS 確證。
[0090] 表6不同取代基實驗
[0096] 實施例22
[0097] -種4-氨基甲酸酯-3-甲氧基肉桂酸胺烷基酰胺類化合物的藥學上可接受的鹽的 制備方法，包括以下步驟：
[0098] 分別取表6中的4-氨基甲酸酯-3-甲氧基肉桂酸胺烷基酰胺類化合物和丙酮攪拌 均勻后加入相應的酸，升溫回流攪拌反應15-30分鐘，反應結束后冷卻至室溫，減壓蒸除溶 劑，殘余物用丙酮重結晶，過濾析出的固體，即得4-氨基甲酸酯-3-甲氧基肉桂酸胺烷基酰 胺類化合物的藥學上可接受的鹽，其化學結構經 1HNR和ESI-MS確證。
[0099] 實施例23
[0100] 采用實施例11所制備的產物進行生物活性篩選實驗。
[0101 ] (1)乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制活性
[0102]向96孔板中依次加入1 .Ommol/L碘化硫代乙酰膽堿或硫代丁酰膽堿(均購自Sigma 公司）30yL，pH7.4的PBS緩沖液40yL，待測化合物溶液20yL(DMS0含量小于1 % )和10yL乙酰 膽堿酯酶(大鼠腦皮層5%勻漿上清液，pH 7.4的磷酸緩沖液作勻漿介質），加畢混勻后，37 °C孵育15min，向各孔中加入質量分數為0 · 2 %的5，5 ' -二硫代-雙(2-硝基)苯甲酸(DTNB，購 自Sigma公司）溶液30yL顯色，用酶標儀測定405nm處各孔的光密度(0D值），與不加待測樣品 的空白孔比較，計算化合物對酶的抑制率[酶抑制率=(1 一樣品組0D值/空白組0D值）X 100%];選擇化合物的五至六個濃度，測定其酶抑制率，并以該化合物摩爾濃度的負對數與 酶的抑制率線性回歸，求得50%抑制率時的摩爾濃度即為該化合物的IC 5Q。測定結果表明， 本發明實施例中所公開的化合物對乙酰膽堿酯酶均具有顯著抑制作用，其IC5Q為0.05μΜ~5 μΜ，且明顯高于相應的阿魏酸脂肪胺烷基酰胺類化合物和阿魏酸取代芐胺烷基酰胺類化合 物，而陽性對照藥物--Rivastigmine對乙酰膽堿酯酶抑制的IC5Q為6.3μΜ;測定結果還表 明，本項目實施例中所公開的化合物對乙酰膽堿酯酶的抑制活性大大高于對丁酰膽堿酯酶 的抑制活性，說明本發明所公開的化合物對乙酰膽堿酯酶具有一定的選擇性抑制作用。 [0103] (2)化合物對Η 202誘導的PC 12細胞損傷的保護作用篩選
[0104] PC12細胞用含10%小牛血清的DMEM培養液，以1X105個/mL密度接種于96孔培養 板上，接種體積為1 〇〇mL/孔，隨后放入含5 %⑶2的37 °C恒溫培養箱內培養。培養24小時后， 給藥組中加相應濃度的化合物(終濃度為l(T5m〇l/L，l(T 6m〇l/L)10mL/孔，預孵育2小時(對 照組與損傷組分別加1〇μ!7孔PBS，使其體積保持相等KPC12細胞孵育2小時后，在給藥組與 損傷組中分別加入100μΜΗ 202損傷劑10μL7孔(對照組加10μL7孔roS)，30分鐘后，將各組的 培養液均換成無小牛血清的RPMI1640培養液繼續放入恒溫培養箱內培養24小時，培養液體 積認為lOOyL/孔。繼續培養24小時后，各組加入5mg/mL，ΜΤΤ100μL7孔，進行活細胞染色。待3 小時后，各組中加入100%DMS0終止液100μL7孔，充分溶解混勻。在490nm的波長下測定各組 的0D值，測試結果重復3次，用Duncan' s test方法統計，各組數值表示為均數土S.E.M.，以 對照組為100%，給藥組及損傷組值以對照組的百分比表示。測定結果表明，本發明實施例 中所公開化合物對過氧化氫誘導的PC12細胞損傷均有顯著的保護作用，且在ΙθΛιοΙ/L濃度 下的抗氧化活性均強于阿魏酸。
[0105] (3)化合物抑制Αβ聚集活性測定
[0106] 取20yL的她―42溶液+20yL的待測化合物溶液、20yL的她―4 2溶液+20yL PBS緩沖液 (含2 %DMS0)、20yL PBS緩沖液（含2%DMS0) +20yL PBS緩沖液（含25 %DMS0)于黑色96孔板 中，化合物和Αβ!-42的最終濃度均為25yiL37°C孵育24h，然后加入160yL含有5μΜ硫黃素 T的 50mM的甘氨酸-NaOH緩沖液（ρΗ = 8 · 5)，振搖5s后立即用Varioskan Flash Multimode Reader (Thermo Scientific)多功能酶標儀在446nm激發波長和490nm發射波長下測定焚光 值;Ah-42+待測化合物的熒光值記錄為IFhAh-42+PBS緩沖液的熒光值記錄為IF。，只含有 PBS緩沖液的熒光值記錄為IFo,由化合物抑制她-42自身聚集的抑制率計算公式為：100-(0^-1?〇)/(1?。-正〇)*100。每個化合物每個濃度測定兩個復孔。測定結果表明，本發明實施 例中所公開的化合物對Afo- 42自身誘導的聚集均具有顯著抑制作用，其IC5Q為Ο.ΙμΜ~20μΜ， 抑制率60-95 %而陽性對照藥物一一姜黃素和阿魏酸在25μΜ濃度下對Α&-42自身誘導聚集 的抑制率分別為56.2%和28.3%。
[0107] (4)血腦屏障透過能力評價(ΡΑΜΡΑ-ΒΒΒ)
[0108] 將豬腦磷脂(PBL，購自Avanti Polar Lipids,Inc.)溶在十二燒（Sigma)中（20mg/ mL)，取4yL滴加在受體孔的親脂性濾膜上以模擬生物膜。在受體孔中加入350yL PBS/EtOH (70:30)緩沖液，在供體孔中加入200yL樣品液(化合物溶解在DMS0中得到5mg/mL儲備液，再 用50倍roS/Et0H(70:30)緩沖液稀釋至最終濃度為100mg/mL。放置96孔濾板于PVDF接收板 (Millipore)上，使磷脂膜能剛好接觸到供體液，如此形成三明治結構-底部是待測物的供 體液，中間是人工磷脂膜，待測藥物分子從供體孔中擴散，穿過磷脂膜，進入到上層受體孔 中。25 °C靜止18h，孵育完畢后，輕輕移走供體板，分別吸取受體液和供體液，用Varioskan Flash Multimode Reader酶標儀測定濃度，每個樣品四孔，獨立測試三次，測試10個波長 (250-450nm)下的0D值，依據公式得出有效透過率(PehPAMPA有效滲透率P e(cm · s'計算 如下：
[01 09] Pe - _VdVa/[ ( Vd+Va)At ] 111 ( l_drUgacceptor/drUgequilibrium)
[0110] 其中，Vd是供體孔的體積，Va是受體孔的體積，A是人工磷脂膜的面積，t表示滲透時 間，drug acceptor是供體孔液體的吸光度，drug equilibrium是理論平衡吸光度，結果以 均值±標準誤差(Stand error，S.E.)表示。測試結果表明，在該實驗條件下本發明所公開 的化合物均具有良好的血腦屏障透過能力，且強于相應的4-位是游離羥基的阿魏酸脂肪胺 烷基酰胺類化合物和4-位是游離羥基的阿魏酸取代芐胺烷基酰胺類化合物。
[0111] (5)化合物對東莨菪堿所致小鼠記憶獲得障礙的影響
[0112] SPF級ICR雄性小鼠，25-30g，隨機分為:正常組、模型組、受試藥高、低劑量組(5.0、 2.5mg/kg)，每組10只動物。一次性灌胃給予受試藥物，空白組和模型組給予溶媒0.5%CMC-Na，給藥體積均為0. lml/10g;藥后45min，正常組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組動物均 注射東莨菪堿(5mg/kg)，給藥體積均為0.1ml/10g;造模30min后，將小鼠放入非電刺激Y迷 宮進行行為學測試。測試時將小鼠放于一臂末端，讓其在迷宮內自由穿行8min，記錄其進入 各臂的次數和交替次數，按照以下公式計算交替率:交替率％ =[交替次數/(總進入次數-2)] X 100,結果以均數±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析。測定結果表明，在該 實驗條件下，本發明所公開的化合物對東莨菪堿致小鼠獲得記憶障礙具有劑量依賴性的改 善作用，與模型組比較均具有統計學差異(P〈〇.01)，且強于相應的4-位是游離羥基的阿魏 酸脂肪胺烷基酰胺類化合物和4-位是游離羥基的阿魏酸取代芐胺烷基酰胺類化合物。
[0113] 行為實驗完畢立即將小鼠斷頭取腦，用預冷生理鹽水沖洗，在冰盒上迅速分離出 腦海馬組織，稱取海馬組織重量，加9倍4°(：生理鹽水制成10%的勻漿，350(^.1^11_ 1，4°(：離心 15min，-20 °C儲存上清液待測，通過考馬斯亮藍測定總蛋白濃度。按照試劑盒規定的方法在 412nm的波長下測定AChE含量，AChE活力表示為U/mgXhAT的活力通過ChAT催化的ACh合成 反應來測定。操作方法同樣根據試劑盒的說明，在412nm波長下測定，ChAT的活力用U/mg來 表示。測定結果表明，在該實驗條件下，本發明所公開的化合物能夠增強乙酰膽堿轉移酶 (ChAT)的活力，與空白組比較均具有統計學差異(p〈0.01)，且強于相應的4-位是游離羥基 的阿魏酸脂肪胺烷基酰胺類化合物和4-位是游離羥基的阿魏酸取代芐胺烷基酰胺類化合 物。
[0114] (6)化合物對乙醇所致小鼠記憶再現障礙的影響
[0115] SPF級ICR雄性小鼠，25-30g，隨機分為:正常組、模型組、受試藥高、低劑量組(5.0、 2.5mg/kg)、卡巴拉汀組(3mg/kg)，每組10只動物。每天灌胃給受試藥物，空白組和模型組給 予溶媒0.5 %CMC-Na，給藥體積均為0. lml/10g，連續給藥32天;在給藥1~24天期間，每日藥 后30min，模型組和各給藥組灌胃0.1ml/10g乙醇（