藥物 (Z-VAD-fmk、葉酸及其衍生物（5-甲基四氫葉酸）、丁酸鈉）加到細胞培養基中，培養48小 時后，細胞用Hoechst 33342和碘化丙啶雙染色，檢測凋亡細胞（紅色）和存活細胞（藍 色），結果見圖2。由圖2可知，葉酸在劑量為10 μ Μ并合用丁酸鈉（100 μ M)時，不能保護 缺氧引起的神經細胞損傷（Ρ>〇. 05);本發明的化合物a和b，當濃度達5 μ Μ時，能有效地保 護缺氧導致的神經細胞損傷（Ρ〈〇. 01)。
[0113] 5)對人胚胎腎細胞（ΗΕΚ293)氧化損傷的保護
[0114] 將人胚胎腎細胞（ΗΕΚ293)接種在含有載玻片的12孔細胞培養板中（30000細胞/ 孔），在完全培養基（含10%的小牛血清）中培養24小時后，向培養基中加入200 μΜ的過 氧化氫（Η202)繼續培養。在加入過氧化氫（Η20 2)后的3小時，將不同濃度的化合物a和b以 及不同濃度的葉酸+ 丁酸鈉加到細胞培養基中，培養48小時，直接在倒置顯微鏡下觀察細 胞密度并拍照。結果見圖3。由圖3可知，葉酸在劑量為25μΜ時并合用丁酸鈉（2500 μΜ) 能保護雙氧水引起的胚胎腎細胞損傷（Ρ〈〇. 05)，然而當葉酸濃度低于5 μΜ時，不能保護雙 氧水引起的胚胎腎細胞損傷（Ρ>〇. 05) ;丁酸鈉濃度低于500 μ Μ時對細胞僅輕度的保護作 用（ρ = 0. 0518)，本發明的化合物a呈劑量依賴的保護作用，化合物b對細胞的保護效果 與化合物a相似，化合物b的結果未顯示。
[0115] 6)對心肌細胞阿霉素損傷的保護
[0116] 將大鼠原代培養的心肌細胞接種在96孔細胞培養板中（10000細胞/孔），在完全 培養基（含10%的小牛血清）中培養24小時后，向培養基中加入1 μΜ的阿霉素繼續培養。 在加入阿霉素后的3小時，將化合物a-e和對照藥物（Z-VAD-fmk、葉酸及衍生物（5-甲基四 氫葉酸）、丁酸鈉等）加到細胞培養基中，培養48小時。細胞用Hoechst 33342染色，檢測 細胞存活率和凋亡發生率，結果見圖4。由圖4可知，葉酸在劑量超過25 μ Μ并合用丁酸鈉 (500 μ Μ)時，能輕度保護阿霉素引起的心肌細胞細胞損傷，葉酸與丁酸鈉合用時并沒有達 到降低劑量仍然能有效保護細胞的目的，但是在各自有效劑量下，呈現協同保護效應；本發 明的化合物a和b與對照藥物Z-VAD-fmk等相比，其保護效應產生了極大的增強：當濃度達 5 μ Μ時，幾乎可阻斷阿霉素導致的心肌細胞損傷（p〈0. 001)，而Caspase抑制劑Z-VAD-fmk 的最大保護效應僅能提高10-15% (p〈0. 05)。引人注目的是，即使在阿霉素處理后的3小 時后，給予本發明的化合物仍能有效保護阿霉素引起的心肌細胞損傷（P〈〇. 005)。結果見圖 4〇
[0117] 試驗例2針對急性心肌梗死的治療
[0118] A.急性心肌梗死模型的建立
[0119] 冠脈結扎法：選用Sprague-Dawly(SD)雄性大鼠，體重200~250g，將SD大鼠用 戊巴比妥鈉（40mg/kg)經腹腔注射麻醉后，按常規方法制備大鼠 MI/R(30min/3h)模型。仰 臥位固定于動物手術板上，常規備皮、消毒、首先在頸正中線做切口，鈍性分離并暴露氣管， 沿3、4氣管軟骨環間進行氣管切開術，插管并接通小型動物呼吸機后，剪斷2根肋骨，打開 胸壁，暴露心臟，小心剪開心包，在左心耳下約3~4mm處左冠動脈前降支與后降支分叉處 用無創傷絲線穿過左冠脈前降支，打結后可見左室前壁及心尖部顏色變暗、搏動減弱。同步 觀察心電圖是否逐漸出現ST段弓背向上抬高、Q波以及QRS波峰降低。結扎30分鐘后，松 開結扎線，恢復血液灌注120分鐘，然后關閉胸腔，然后依次縫合肌肉及皮膚。再灌注24h 后檢測心梗面積、心功能、心肌細胞凋亡及氧化/硝化應激、炎癥等指標檢測。假手術組采 用同樣的方法處理，只是不進行冠脈結扎術。
[0120] B.治療實驗（分三部分）
[0121] 1.使用試驗例2A得到的大鼠急性心肌梗死模型測試本發明的化合物對急性心肌 梗死大鼠模型的療效。將大鼠隨機分為以下編號為a-g的7組（每組包括8只大鼠模型）： a.假手術組（SHAM)，冠脈下穿線不結扎；b.心肌缺血/再灌注（MI/R)組；陽性治療組包 括：c.Z_VAD-fmk(23mg/kg Z-VAD_fmk = 50yM) ;d.尼可地爾（0.1mg/kg) ;e.葉酸 + 丁酸 鈉組（FA :3. 2mg/kg = 8 μ M+BA-Na :36mg/kg = 200 μ M) ;f.本發明的化合物 a(a :5mg/kg = 8 μΜ) ;g.本發明的化合物b(b :5. lmg/kg = 8 μΜ)。在急性心肌梗死大鼠模型造成后（缺 血后）的半小時，從股靜脈或腹腔緩慢注射給藥，連續給藥2天，每天給藥2次。
[0122] 2.在另一個治療試驗中，采用本發明的化合物b的低、中、高三個濃度：
[0123] 低：lmg/kg = 1.7 μΜ;
[0124] 中：3mg/kg = 5 μ Μ ;
[0125] 高：9mg/kg = 15 μ Μ ;
[0126] 甲基四氫葉酸（MTFA)+ 丁酸鈉（ΒΑ)組的低、中、高三個濃度：
[0127] 低：FA : lmg/kg = 2. 7 μ M+BA: 12. 7mg/kg = 67 μ Μ ;
[0128] 中：FA :3mg/kg = 7 μ Μ+ΒΑ :37. 3mg/kg = 200 μ Μ ;
[0129] 高：FA :9mg/kg = 21 μ Μ+ΒΑ :112mg/kg = 600 μ Μ ;
[0130] 進行治療試驗。
[0131] 3.在另一個治療試驗中，在再灌注3小之后靜脈或腹腔給予本發明的高劑量的化 合物 b (9mg/kg)和 FA+BA (30mg/kg+336mg/kg)。
[0132] 觀測指標
[0133] 1.心臟功能檢測：通過多導生理記錄儀（RM-4200)持續監測大鼠心電圖及血流動 力學各指標。心電圖、左室發展壓（LVDP)、左室等容收縮/舒張期壓力上升或下降最大速率 (土 dP/dtmax)等均通過數據分析系統由計算機自動采集、記錄并計算。
[0134] 2.心肌梗死范圍測定：第5天取血后取出大鼠心臟，去掉心房組織及脂肪，稱重， 將左心室心肌橫切5片，然后浸入氯化硝基四氮唑藍（NBT)磷酸緩沖液中，置37°C恒溫水浴 染色30分鐘后取出切片，正常組織染色，缺血組織不染色，切下缺血心肌稱重，用缺血心肌 與左心室濕重的百分比計算梗死比例（MIS% )。
[0135] 3.血生化指標包括炎癥指標的檢測：在第3小時和24小時抽取全血用全自動生 化分析儀器（UniCel DxC 600Synchron，Beckman，美國）測定血清心肌酶譜（谷草轉氨酶/ AST、乳酸脫氫酶/LDH、肌酸激酶同工酶/CKMB);采用雙抗體夾心ELISA法檢測血TNF、IL-6 的變化。
[0136] 4.與細胞存活和死亡相關蛋白的檢測：用免疫印跡（Western Blots)方法 檢測心肌組織P53,誘導型一氧化氮合酶（iNOS)，熱休克蛋白70(Hsp70)，金屬硫蛋白 l(Metallothionein 1，MT1)表達的變化。
[0137] 5.心肌細胞凋亡指數（AI)及caspase-3活性：心肌細胞凋亡的檢測用末端標記 法，Caspase-3活性測定用Western Blots，用抗PARP的抗體測定PARP被切割的情況。
[0138] 6.抗氧化指標的檢測：丙二胺（MDA)含量用硫代巴比妥酸比色法，超氧氧化物歧 化酶（S0D)含量采用黃嘌呤氧化酶法測定，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px)含量采用二硫代 二硝基苯甲酸法檢測。
[0139] 結果
[0140] 1.心臟功能的變化：為觀察研發藥物對缺血心臟功能是否具有保護作用，監測 了大鼠的血流動力學指標。缺血前各指標的基礎值無明顯差異。再灌注后，各組間心率 (HR)無統計學差異；LVDP值SHMA正常對照組為（20±2)kPa，MI/R組比SHAM組有顯著 降低[(5±L l)vs(20±2)kPa，η = 8, Ρ〈0· 01] ;FA[(6. 1±L l)kPa，η = 8, P > 0· 05]; MTFA[(6. 7±L 3)kPa，η = 8, P > 0· 05];尼可地爾[(10. 9±L 2)kPa，η = 8, P > 0· 05]; FA+BA[(7. 3±L 6)kPa，η = 8, P > 0· 05] ;Z-VAD-fmk[(6. 9±L l)kPa，η = 8, P > 0· 05]; a[(15. 8±1. 7)kPa，n = 8, P〈0. 01] ;b[(17. 1±1. 9)kPa，n = 8, P〈0. 01]。
[0141] 除本發明的化合物a和b外，其它藥物組均不能使LVDP較I/R組顯著升高。令人 印象深刻的是，Z-VAD-fmk雖然能有效地保護缺血導致的體外培養的心肌細胞的損傷，然而 Z-VAD-fmk卻不能有效改善動物缺血心肌的心功能，尼可地爾有中度改善LVDP的作用。
[0142] 2.心肌梗死范圍和心肌血清酶學的變化：心肌梗死面積和血清酶學指標結果 匯總見表2,其表明本發明合成的化合物對心肌缺血再灌注損傷有強保護作用，明顯優于 Z-VAD-fmk組、尼可地爾以及葉酸+ 丁酸組，其中在本試驗給定的濃度下（FA :5μΜ，BA : 200 μΜ)未有明顯的保護作用。即使在缺血半小時后給予本發明的化合物a或b仍然能將 梗死面積縮小近3倍，表明本發明的化合物能阻斷已經激活的死亡傳導通路，有很重要的 臨床應用價值。