多孔性纖維素粒子、色譜載體、病毒樣顆粒的純化方法和疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種具有含氨基的離子交換基與含丁基的疏水性基的多孔性纖維素 粒子及含有所述多孔性纖維素粒子的色譜載體。另外，本發明涉及一種使用該色譜載體的 乙型肝炎病毒的病毒樣顆粒的純化方法。
【背景技術】
[0002] 乙型肝炎為由乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV)所引起，推測世界上存 在約4億人以上的攜帶者（carrier)、且每年50萬人以上死亡的重大疾病。關于其預防， 以乙型肝炎表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBs抗原）作為有效成分的疫苗 (vaccine)有效，目前從第一代的使用病毒本身的減毒疫苗開始，第二代的無感染性的病毒 樣顆粒（Virus Like Particle，VLP)疫苗成為主流。VLP為人工制作從具有感染性及傳 播性的病毒中去掉基因或核心蛋白質等來源于細胞的混入物質而成的模擬病毒粒子，當前 日本國內所承認的兩種HBV疫苗是以如下VLP作為主成分，該VLP是使用基因重組技術制 作HBV表面抗原的除了 Pre-Si及Pre-S2以外的S區域而成。該重組蛋白質的宿主有大腸 菌、酵母及動物細胞等，其中，使用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、巴斯得畢赤酵 母（Pichia pastoris)、漢遜酵母（Hansenula polymorpha)等酵母的制法為主流。
[0003] 乙型肝炎病毒的VLP疫苗的制造包含上游工序與下游工序，所述上游工序培養 VLP產生重組微生物而制作疫苗，所述下游工序通過離心分離等將培養液澄清化，使用親和 色譜、疏水性色譜及離子交換色譜等各種色譜而從共雜物中除去混入物質，使用微濾?超濾 膜等進行最終過濾而將疫苗分離純化。特別在利用色譜的純化工序中，已知具有獨自的分 離特性的混合模式（mix mode) ·色譜載體的使用有效。
[0004] 以前已知以下方法：在利用色譜的分離純化工序中，通過使用丁基瓊脂糖色譜載 體的親和色譜來將培養液分離純化，其中所述丁基瓊脂糖色譜載體是使正丁基胺共價鍵 合在瓊脂糖微球（agarose beads)上而成（美國專利第4707542號說明書（專利文獻1) 及日本專利特開昭62-258398號公報（專利文獻2)等）。該方法中，采用使目標物以低氯 化鈉濃度吸附、并使用表面活性劑使之溶出的有利于擴大規模（scale-up)純化的方法。然 而，通常在制造丁基瓊脂糖色譜載體時使用作為有毒物質的溴化氰，不可謂于制法方面優 選。另外，副產生若干衍生物，因此在穩定供給同一產品的方面存在問題。另外，該方法中， 在瓊脂糖微球中等量地導入丁基與氨基，因此無法自由調節分離特性。
[0005] 另外，作為其他方法，已知通過使用輕磷灰石（hydroxyapatite)載體的親和色譜 來將培養液分離純化的方法（日本專利特開昭60-78999號公報（專利文獻3))。然而該方 法中，必須組合昂貴且需要初期投資的超離心法。另外，在親和色譜的前處理階段中使用不 適于工業生產的硫酸銨沉淀法，并未實現實用化。
[0006] [現有技術文獻]
[0007] [專利文獻]
[0008][專利文獻1]美國專利第4707542號說明書 [0009][專利文獻2]日本專利特開昭62-258398號公報 [0010][專利文獻3]日本專利特開昭60-78999號公報
【發明內容】
[0011][發明所要解決的問題]
[0012] 在這種狀況下，期望提供一種可在有利于擴大規模純化的條件下使用、且可自由 調節分離特性的色譜載體。另外，期望提供一種在不使用有毒物質的情況下可穩定供給的 色譜載體。
[0013] [解決問題的技術手段]
[0014] 本發明人等為了解決所述問題而進行了努力研究，結果發現，通過將含氨基的離 子交換基與含丁基的疏水性基分別導入到纖維素粒子中，可自由調節疏水性基及離子交換 基的量比，可根據用途而提供具有所需分離特性的色譜載體。本發明人等進一步發現，通過 使具有丁基與縮水甘油基的化合物與纖維素粒子所含的羥基的一部分反應，可在纖維素粒 子中導入含丁基的疏水性基，然后使表鹵醇與該羥基的另一部分反應而環氧化后，添加氨 水進行反應，由此可導入含氨基的離子交換基。根據該方法，可在不使用有毒物質的情況 下，分別獨立地以任意的量導入多孔性纖維素粒子中所導入的疏水性基及離子交換基。本 發明人等發現，所得的本發明的色譜用載體對于乙型肝炎病毒的VLP疫苗的純化等有用， 以至完成了本發明。
[0015] 即，本發明涉及以下所示的多孔性纖維素粒子、色譜載體及乙型肝炎病毒的病毒 樣顆粒的純化方法等。
[0016] [1] -種多孔性纖維素粒子，具有含氨基的離子交換基與含丁基的疏水性基，并且 多孔性纖維素粒子中的氮原子含量為lmg/g~10mg/g的范圍。
[0017] [2]根據[1]所述的多孔性纖維素粒子，其中多孔性纖維素粒子是由交聯纖維素 粒子所得，所述交聯纖維素粒子是通過交聯劑將作為所述多孔性纖維素粒子的基質載體的 纖維素粒子交聯而成。
[0018] [3]根據[2]所述的多孔性纖維素粒子，其中交聯劑為表氯醇。
[0019] [4]根據[1]至[3]中任一項所述的多孔性纖維素粒子，其中含氨基的離子交換基 為3-氨基-2-羥基丙基，含丁基的疏水性基為3- 丁氧基-2-羥基丙基。
[0020] [5] -種色譜載體，含有根據[1]至[4]中任一項所述的多孔性纖維素粒子。
[0021] [6]根據[5]所述的色譜載體，其是用來將乙型肝炎病毒（HBV)的病毒樣顆粒 (VLP)純化。
[0022] [7]根據[6]所述的色譜載體，其中VLP為HBs抗原的S區域。
[0023] [8] -種方法，其為使用根據[6]或[7]所述的色譜載體將乙型肝炎病毒（HBV)的 病毒樣顆粒（VLP)純化的方法，并且包括以下工序：
[0024] (a)使根據[6]或[7]所述的色譜載體與含有乙型肝炎病毒（HBV)的病毒樣顆粒 (VLP)的細胞溶解物或培養上清液接觸，使所述VLP以及作為混入物質的蛋白質及核酸吸 附到所述色譜載體上；以及
[0025] (b)以將作為混入物質的蛋白質及核酸保持在所述色譜載體上、VLP透過所述色 譜載體的方式，調節所述色譜載體的疏水性相互作用，使所述VLP從所述色譜載體上溶出。
[0026] [9]根據[8]所述的方法，VLP為HBs抗原的S區域。
[0027] [10]根據[8]或[9]所述的方法，其中在工序（b)中，所述色譜載體的疏水性相互 作用是通過使用表面活性劑及有機溶劑作為流動相來調節。
[0028] [11] -種疫苗，含有通過根據[8]至[10]中任一項所述的方法所制備的所述 VLP〇
[0029] [發明的效果]
[0030] 本發明的多孔性纖維素粒子可分別獨立地以任意的量導入含氨基的離子交換基 及含丁基的疏水性基。通過調節多孔性纖維素粒子中的疏水性基及離子交換基的導入量及 其量比，可賦予所需的分離特性。根據本發明的優選形態，本發明的多孔性纖維素粒子可在 不使用有毒物質的情況下制造，且可穩定供給。
[0031] 本發明的多孔性纖維素粒子可在有利于擴大規模純化的條件下使用，可合適地用 作混合模式?色譜載體。本發明的色譜載體尤其對于乙型肝炎病毒的VLP的純化有用。通過 使用本發明的色譜載體，可將乙型肝炎病毒的VLP與蛋白質及核酸等混入物質分離純化。
【附圖說明】
[0032] 圖1為使用本發明的色譜載體來純化HBs抗原時的色譜圖。 圖2為多孔性纖維素粒子的制造方法的流程圖。
【具體實施方式】
[0033] 以下，對本發明的多孔性纖維素粒子、色譜載體、乙型肝炎病毒的病毒樣顆粒的純 化方法等加以詳細說明。
[0034] <多孔性纖維素粒子>
[0035] 本發明的多孔性纖維素粒子具有含氨基的離子交換基與含丁基的疏水性基，且所 述多孔性纖維素粒子中的氮原子含量為lmg/g~10mg/g的范圍。像上文所述那樣，本發明 的多孔性纖維素粒子可分別獨立地以任意的量導入含氨基的離子交換基與含丁基的疏水 性基。
[0036] 含氮基的離子交換基只要至少含有氨基，且可導入到纖維素粒子的羥基上，則并 無特別限制。例如可舉出：可經由多官能性化合物使氨基加成在纖維素粒子上的基團等。 具體可舉出：通過經表氯醇活化后接著加成氨而導入的3-氨基-2-羥基丙基等。