毒物質的情況下，一面抑制反 應上衍生物的副產生一面利用簡便的方法進行制造，因此在穩定供給的方面也優異。
[0060] 所述多孔性纖維素粒子例如可通過圖2所示的方法來制造。
[0061]
[0062] 〈工序 a>
[0063]
[0064] 首先，使丁基縮水甘油醚與交聯纖維素粒子反應而導入丁基。
[0065] 在反應容器中添加水及硫酸鈉，進而添加交聯纖維素粒子，以成為均勻漿料的方 式攪拌。在其中添加氫氧化鈉水溶液，攪拌〇. 5小時~2. 0小時。
[0066] 然后，添加丁基縮水甘油醚，將反應液升溫到45°C~55°C，當液溫達到一定溫度 后，一面攪拌6小時~48小時一面進行反應。
[0067] 反應結束后，可對反應液進行抽吸過濾，以水清洗所得的濕凝膠直到變為中性為 止，以濕凝膠的形式獲得在交聯纖維素粒子中導入有丁基的化合物。
[0068] 相對于反應液中的水分，硫酸鈉的使用量通常為5質量％~50質量％的范圍，優 選20質量％~30質量％的范圍。
[0069] 關于氫氧化鈉水溶液的濃度及使用量，優選的是以反應液中的濃度成為1質 量％~10質量％的方式添加。
[0070] 丁基縮水甘油醚的使用量可根據欲導入到交聯纖維素粒子中的丁基的量而適當 調整。例如優選的是纖維素單體的摩爾數的0. 05倍量~2. 0倍量，更優選0. 1倍量~0. 6 倍量，進而優選〇. 2倍量~0. 4倍量。這里所謂"纖維素單體"，是指作為纖維素的結構單元 的葡萄糖（glucose)單元，纖維素單體的摩爾數（即，聚合度）是將從1單元葡萄糖中扣去 水分的量、即分子量162設為1摩爾，根據纖維素的干燥重量而計算。
[0071] < 工序 b>
[0072] 然后，將工序a中所得的導入有丁基的交聯纖維素的羥基的另一部分環氧化。
[0073] 在反應容器中添加水及工序a中所得的濕凝膠，攪拌0. 5小時~2. 0小時。然后， 將反應液升溫到25°C~35°C，當液溫達到一定溫度后，依次添加氫氧化鈉水溶液、表氯醇， 攪拌1. 0小時~5. 0小時。
[0074] 反應結束后，添加乙酸等弱酸直到反應液變為中性為止，以水清洗后，將反應液抽 吸過濾而獲得經環氧化的濕凝膠。
[0075] 關于氫氧化鈉水溶液的濃度及使用量，優選的是相對于反應液中的水分而為1質 量％~20質量％，且相對于表氯醇而為1倍量~10倍量。
[0076] 表氯醇的使用量可根據后續工序中欲導入到交聯纖維素粒子中的氨基的量而適 當調整。例如，優選的是工序a中所得的濕凝膠的纖維素單體的摩爾數的0. 1倍量~50倍 量，更優選1. 0倍量~20倍量，進而優選5. 0倍量~10倍量。
[0077] < 工序 c >
[0078] 接著，經由工序b中所得的經環氧化的交聯纖維素的環氧基而導入氨基。
[0079] 在反應容器中添加工序b中所得的濕凝膠及氨水，以成為均勻漿料的方式攪拌。 將該反應液升溫到30°C~40°C，當液溫達到一定溫度后，在維持液溫的狀態下一面攪拌 1. 0小時~5. 0小時一面進彳丁反應。
[0080] 反應結束后，可將反應液抽吸過濾，對所得的濕凝膠進行清洗直到變為中性為止， 以濕凝膠的形式獲得在交聯纖維素粒子中導入有丁基及氨基的化合物。
[0081] 氨水的使用量優選的是纖維素單體的摩爾數的10倍量以上。
[0082] 根據該方法，可在不使用有毒物質的情況下，利用簡便的方法制造多孔性纖維素 粒子。另外，就反應上而言不易副產生衍生物，因此可穩定供給同一產品。
[0083] <色譜載體>
[0084] 本發明的多孔性纖維素粒子通過導入氨基及丁基而具有離子交換相互作用及疏 水性相互作用。可利用該性質，將本發明的多孔性纖維素粒子合適地用作例如色譜載體。本 發明的多孔性纖維素粒子可調節氨基及丁基的導入量及其量比，因此可控制離子交換相互 作用及疏水性相互作用的平衡，賦予與目標相應的所需分離特性。另外，通過使離子交換相 互作用及疏水性相互作用的平衡變化，可控制目標物質的吸附及溶出。
[0085] 另外，本發明的色譜載體使用纖維素粒子作為基質凝膠，因此可在廣的pH值范圍 內使用，可在使目標物以低氯化鈉濃度吸附、并利用表面活性劑使之溶出的有利于擴大規 模純化的條件下使用。另外，本發明的色譜載體也具有不使用有毒物質、可穩定供給的優 點。
[0086] 具體來說，本發明的多孔性纖維素粒子的用途例如可優選地舉出用來將乙型肝炎 病毒（HBV)的病毒樣顆粒（VLP)純化的混合模式?色譜載體。VLP優選的是使用基因重組 技術來制造 HBs抗原的S區域而成。通過使用本發明的多孔性纖維素粒子，可從乙型肝炎 病毒（HBV)的病毒樣顆粒（VLP)中將來源于細胞的混入物質除去。
[0087] <乙型肝炎病毒（HBV)的病毒樣顆粒（VLP)的純化>
[0088] 像上文所述那樣，本發明的多孔性纖維素粒子可合適地用作用來將乙型肝炎病毒 (HBV)的病毒樣顆粒（VLP)純化的混合模式?色譜載體。根據本發明的乙型肝炎病毒（HBV) 的病毒樣顆粒（VLP)的純化方法，可通過使用本發明的色譜載體而將乙型肝炎病毒（HBV) 的病毒樣顆粒（VLP)以工業方式純化。
[0089] 本發明的色譜載體可在酸性范圍內使用，因此例如也可用作美國專利第4707542 號說明書中記載的現有方法中所用的混合模式·色譜的丁基瓊脂糖的代替品。通過使用本 發明的色譜載體代替丁基瓊脂糖色譜載體，可實現擴大規模純化，且可在不使用有毒物質 的情況下穩定地將乙型肝炎病毒（HBV)的病毒樣顆粒（VLP)以工業方式純化。
[0090] 例如，本發明的乙型肝炎病毒（HBV)的病毒樣顆粒（VLP)的純化方法可包括以下 工序：
[0091] (a)使含有乙型肝炎病毒（HBV)的病毒樣顆粒（VLP)的細胞溶解物或培養上清液 與本發明的色譜載體接觸，使所述VLP以及作為混入物質的蛋白質及核酸吸附到所述色譜 載體上的工序；
[0092] (b)以將作為混入物質的蛋白質及核酸保持在所述色譜載體上、且VLP透過所述 色譜載體的方式，調節所述色譜載體的疏水性相互作用，使所述VLP從所述色譜載體中溶 出的工序。
[0093] 首先，制備含有乙型肝炎病毒（HBV)的病毒樣顆粒（VLP)的細胞溶解物或培養上 清液。
[0094] 含有乙型肝炎病毒（HBV)的病毒樣顆粒（VLP)的細胞溶解物是通過以下方式獲 得：以利用重組DNA技術而產生VLP的方式，在適當的培養基及培養條件下對經轉形的VLP 產生重組微生物、例如大腸菌、酵母及動物細胞等進行培養，產生VLP并使之蓄積后，對所 得的培養液在緩沖液中進行破碎處理。
[0095] VLP產生重組微生物優選的是使用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、巴斯 得畢赤酵母（Pichia pastoris)、漢遜酵母（Hansenula polymorpha)等酵母。
[0096] 破碎處理例如可通過以下方法實施：超聲波破碎；玻璃微球破碎；曼頓?格林 (Manton Gorlin)破碎；或使細胞的細胞壁進行酶溶解而制成去壁細胞（speroplast)后， 使表面活性劑作用于該去壁細胞而進行破碎等方法。
[0097] 所得的細胞溶解物也可實施離心分離，將細胞壁碎片等破碎物分離，視需要使用 薄膜過濾器進行過濾處理將大的粒子物去掉而制成培養上清液。
[0098] 所得的細胞溶解物或培養上清液在供于本發明的色譜載體之前，視需要也可使用 利用聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG)的沉淀、利用CaClJtl沉淀、超離心、離子交換 色譜、疏水色譜、親和色譜、凝膠過濾、利用二氧化硅凝膠的吸附、超濾、透析等方法或這些 方法的組合來進行清涼化處理。
[0099] 通過使所得的細胞溶解物或培養上清液與本發明的色譜載體接觸，而使VLP以及 作為混入物質的蛋白質及核酸吸附到該色譜載體上，且使作為非吸附物的其他雜質分離溶 出。此時，細胞溶解物或培養上清液的pH值可利用緩沖液來調節。例如將pH值調節為小 于7或7以上。由此，有可將無法除去的雜質除去的可能性。
[0100] 緩沖液可使用磷酸鹽、羧酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris緩沖液、Bis-Tris 緩沖液或GoocT s緩沖液等。緩沖液的濃度優選ImM~lOOOmM的范圍，更優選5mM~ 200mM，進而優選10mM~50mM的范圍。