濕凝膠。所得的凝膠的環氧導入量在每lg干燥凝膠中為229 μ mol。
[0140] [混合模式載體的制造氨基的導入（工序c)]
[0141] (制造例 lc)
[0142] 在容量為0. 3L的玻璃容器中添加50g的工序b(制造例lb)中制造的濕凝膠與 75mL的25%氨水，以成為均勻漿料的方式攪拌。將反應液的溫度提高到35°C~40°C，在維 持溫度的狀態下攪拌2小時。2小時后，通過抽吸過濾而除去濾液，以純水清洗直到上清液 變為中性為止。然后，通過減壓過濾將多余的水分除去，獲得34g的濕凝膠。使凝膠干燥， 通過碳氫氮（Carbon Hydrogen Nitrogen，CHN)元素分析求出干燥重量單位的氮原子含量。 所得的凝膠的氮原子含量為2400ppm(2. 4mg/g)。
[0143] (制造例 2c)
[0144] 除了使用50g的制造例2b中制造的濕凝膠以外，與制造例lc同樣地進行操作而 獲得33g的濕凝膠。所得的凝膠的氮原子含量為3100ppm(3. lmg/g)。
[0145] (制造例 3c)
[0146] 除了使用50g的制造例3b中制造的濕凝膠以外，與制造例lc同樣地進行操作而 獲得34g的濕凝膠。所得的凝膠的氮原子含量為5000ppm(5. Omg/g)。
[0147] <實施例2 >
[0148] [HBsAg粗純化液的制備]
[0149] 含有HBsAg的酵母S. cerevisiae (釀酒酵母）菌體是從媒介（Vehicle)公司購 入，在-80°C下保存直到使用為止。以維持4°C以下的方式進行移動的操作。將約30g的菌 體懸浮在100mL的破碎用緩沖液（0· lmol/L的磷酸鈉，0· 5mol/L的NaCl，2mmol/L的PMSF， pH值為7. 2)中，使用玻璃微球均質機進行破碎處理。以13000g將該破碎液離心而除去菌 體破碎物。回收上清液，以成為最終濃度10% (w/w)的方式一面緩緩攪拌，一面緩緩添加 33% (w/w)PEG6000,攪拌2小時。停止攪拌，保持原狀放置一夜后，以8000g進行30分鐘離 心。利用0. 05mol/L的pH值為8. 0的Tris-HCl以蛋白質濃度成為5mg/mL左右的方式將 所得的沉淀適當地懸浮，利用孔徑0. 2 μπι的過濾器進行過濾。蛋白質濃度是使用二辛可寧 酸（Bicinchonininc acid，BCA)分析（賽默飛世爾科技（Thermo Scientific))進行測定。
[0150] 然后，使用參考例2中制造的陰離子交換體將該含有HBsAg的溶液純化。以純水將 陰離子交換體適當制成漿料狀，在減壓下攪拌、脫氣。將該漿料流入到Φ 16mm的玻璃管柱 中，以凝膠高度成為50mm的方式裝填。將填塞有凝膠的玻璃管柱連接于液相色譜（Liquid Chromatography，LC)系統，以0· 02mol/L的pH值為8. 0的Tris-HCl進行平衡化。在其中 以流速2. OmL/分鐘的速度流通20mL的含有HBsAg的溶液，然后流通管柱的8倍容量的含 有0· 05mol/L的NaCl的0· 02mol/L的pH值為8. 0的Tris-HCl而除去非吸附物。進而，以 5mL/分鐘的速度流通管柱的8倍容量的含有0· 3mol/L的NaCl的0· 02mol/L的pH值為8. 0 的Tris-HCl，以2. 5mL為單位回收溶出液。收集所回收的溶出份（fraction)中蛋白質濃度 為300mg/mL以上的溶出份，以0. 02mol/L的pH值為7. 0的磷酸緩沖液進行透析，將所得物 品作為后續色譜的樣品。
[0151] [利用混合模式載體的HBsAg純化]
[0152] 以純水將實施例1的制造例2c中制作的混合模式載體適當制成漿料狀，在減壓下 攪拌、脫氣。將該漿料流入到Φ6. 6mm的玻璃管柱中，以凝膠高度成為30mm的方式裝填。 將填塞有凝膠的玻璃管柱連接于LC系統，以0. 02mol/L的pH值為7. 0的磷酸緩沖液進行 平衡化。在其中以流速〇. 5mL/分鐘的速度流通2mL的所制備的HBsAg樣品液（HBsAg粗純 化液），然后流通管柱的8倍容量的0. 02mol/L的pH值為7. 0的磷酸緩沖液而除去非吸附 物。然后，流通管柱的10倍容量的含有〇· 1% (w/w)曲拉通（Triton)X-lOO的0· 02mol/L 的pH值為7. 0的磷酸緩沖液并回收溶出液。進而流通管柱的10倍容量的含有0. 1 % (w/w) 曲拉通（Triton)X-100、2mol/L的NaCl的0· 02mol/L的pH值為7. 0的磷酸緩沖液并回收 殘留物。各組分的HBsAg濃度是利用酶聯免疫吸附測定（Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)套組（媒介（Vehicle)股份有限公司）進行測定，核酸濃度是利用"皮高格 林（PicoGreen)(注冊商標）"（生命科技（Life Technologies)公司）進行測定。將結果 示于圖1及表1中。
[0153] [表 1]
[0154] 收支表
[0155]
[0156] 像表1所示那樣，通過使用本發明的色譜載體，可在溶出組分1中回收乙型肝炎病 毒（HBV)的病毒樣顆粒（VLP)。通過進一步調節本發明的色譜載體的分離特性，可制備純度 更高的VLP。
[0157] [工業上的可利用性]
[0158] 本發明的多孔性纖維素粒子具有離子交換相互作用及疏水性相互作用，通過適當 調節這些作用的平衡，可顯示出獨自的分離特性，因此作為用于生物醫藥品的純化等的色 譜載體而有用。特別可合適地用作乙型肝炎病毒（HBV)的病毒樣顆粒（VLP)純化用的色譜 載體。
【主權項】
1. 一種多孔性纖維素粒子，其具有含氨基的離子交換基與含丁基的疏水性基，且多孔 性纖維素粒子中的氮原子含量為lmg/g~10mg/g的范圍。2. 根據權利要求1所述的多孔性纖維素粒子，其中多孔性纖維素粒子是由交聯纖維素 粒子所得，其中所述交聯纖維素粒子是通過交聯劑使作為其基質載體的纖維素粒子交聯而 成。3. 根據權利要求2所述的多孔性纖維素粒子，其中交聯劑為表氯醇。4. 根據權利要求1至3中任一項所述的多孔性纖維素粒子，其中含氨基的離子交換基 為3-氨基-2-羥基丙基，含丁基的疏水性基為3- 丁氧基-2-羥基丙基。5. -種色譜載體，其含有根據權利要求1至4中任一項所述的多孔性纖維素粒子。6. 根據權利要求5所述的色譜載體，其是用來將乙型肝炎病毒的病毒樣顆粒純化。7. 根據權利要求6所述的色譜載體，其中病毒樣顆粒為乙型肝炎表面抗原的S區域。8. -種病毒樣顆粒的純化方法，其為使用根據權利要求6或7所述的色譜載體將乙型 肝炎病毒的病毒樣顆粒純化的方法，且其包括以下工序： (a) 使含有乙型肝炎病毒的病毒樣顆粒的細胞溶解物或培養上清液與根據權利要求6 或7所述的色譜載體接觸，使所述病毒樣顆粒以及作為混入物質的蛋白質及核酸吸附到所 述色譜載體上的工序；以及 (b) 以將作為混入物質的蛋白質及核酸保持在所述色譜載體上、且病毒樣顆粒透過所 述色譜載體的方式，調節所述色譜載體的疏水性相互作用，使所述病毒樣顆粒從所述色譜 載體中溶出的工序。9. 根據權利要求8所述的病毒樣顆粒的純化方法，其中病毒樣顆粒為乙型肝炎表面抗 原的S區域。10. 根據權利要求8或9所述的病毒樣顆粒的純化方法，其中在工序（b)中，所述色譜 載體的疏水性相互作用是通過使用表面活性劑及有機溶劑作為流動相來調節。11. 一種疫苗，其含有通過根據權利要求8至10中任一項所述的病毒樣顆粒的純化方 法所制備的所述病毒樣顆粒。
【專利摘要】本發明提供一種多孔性纖維素粒子、色譜載體、病毒樣顆粒的純化方法和疫苗，可在有利于擴大規模純化的條件下使用、且可自由調節分離特性的色譜載體及乙型肝炎病毒(HBV)的病毒樣顆粒(VLP)的純化方法。本發明將如下多孔性纖維素粒子用作色譜載體，所述多孔性纖維素粒子具有含氨基的離子交換基與含丁基的疏水性基，并且多孔性纖維素粒子中的氮原子含量為1mg/g～10mg/g的范圍。
【IPC分類】C12N7/02, C08L1/08, A61P31/20, C08B15/06, C08J3/24, C08B11/02, A61K39/29, A61P1/16
【公開號】CN105646912
【申請號】
【發明人】北川祐歌, 內田昭博, 梅田靖人
【申請人】捷恩智株式會社
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2015年11月23日