mL)，NYBD培養基（牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖 l〇g，蒸餾水l〇〇〇mL)，初始發酵培養基（牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，蒸餾水1000mL)， YPG培養基(胰蛋白胨5g，葡萄糖5g，酵母膏5g，蒸餾水lOOOmL)和BY培養基（牛肉膏5g，氯化 鈉5g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，蒸餾水lOOOmL)。28°0、180rpm/min振蕩培養24h，以0D6QQ和發 酵液抑菌活性為指標，檢測菌株最適培養基。結果表明，基礎發酵培養基菌液〇D 6QQ值最高， 為0.255，抑菌率為56.50 %，NA培養基的值最小，為0.140，抑菌率為42.005 % (結果見表2)。 [0041 ]表2TWC2菌株在不同培養基條件下的生長情況
[0042]
[0043]注：同列數據后不同大小寫字母分別表示差異達極顯著(p<0.01)和顯著水平(p <0.05)，下同。
[0044] 4.2培養基的優化
[0045] 基礎發酵培養基:葡糖糖10g，蛋白胨10g，KH2P〇4〇. 2g，MgS〇4〇. 2g，蒸餾水1 OOOrnL。
[0046] 4.2.1最佳碳源
[0047] 以基礎發酵培養液中原有成分不變的前提下，以1%的木糖、蔗糖、可溶性淀粉、果 糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、淀粉、葡萄糖、山梨醇為碳源，于28 °C，180rpm/min的搖床培養 48h，測定其0D6QQ和發酵液抑菌活性。結果表明，從TWC2菌株的0D值來看，各種碳源的0D值 差異較大，其中，麥芽糖的OD600最大，為0.812，葡萄糖的OD600最小;從抑菌率來看，當果糖為 碳源時，TWC2菌株的抑菌率最大，為55.00 %，其他依次為麥芽糖、甘露醇、淀粉、山梨醇、葡 萄糖、乳糖、木糖、蔗糖、可溶性淀粉(結果見表3)。因此，選用果糖和麥芽糖作為優化培養基 的復合碳源。
[0048] 表3TWC2菌株在不同碳源條件下的生長情況
[0049]
[0050] 4.2.2最佳氮源篩選
[0051] 分別用l%(m/V)含量的麩皮、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、尿素、氯化銨、硝酸銨、酵 母粉:胰蛋白胨=(1:1)、酵母粉:胰蛋白胨:氯化銨=(2:2:1)、蛋白胨:酵母浸出粉:硝酸銨 = (2:2:1)等10種氮源，替換基礎發酵培養基中的蛋白胨，其他條件同上。試驗表明，當氮源 為酵母粉：胰蛋白胨=(1:1)時，TWC2菌株的0D 6QQ值和抑菌率均最高，分別達到0.433， 48.210%，其次氮源為蛋白胨:酵母浸出粉:氯化銨=(2:2:1)、麩皮、牛肉浸膏、蛋白胨:酵 母浸出粉:硝酸銨=(2:2:1)、酵母浸出粉和蛋白胨時，TWC2菌株的0D 6QQ值和抑菌率也較高， 但當氮源為尿素、氯化銨、硫酸銨時，OD600值和抑菌率最低，均為0(結果見表4)。因此，選用 蛋白胨:酵母浸出粉=1:1作為優化培養基的氮源。
[0052] 表4TWC2菌株在不同氮源條件下的生長情況
[0053]
[0054]
[0055] 4.2.3最佳金屬離子篩選
[0056] 分別按〇· l%(m/V)含量添加 1〇12?〇4、卩65〇4、2115〇4、似(：1、]\1115〇4、]\%5〇4、〇3(：12和(：115〇4 等8種無機鹽，對照為不添加無機鹽離子的培養基，其他條件同上。試驗表明，與對照不添加 無機鹽離子的培養基相比，當添加氯化鈣培養基的OD600值和抑菌率均顯著增加，分別為 2.224和60.780 %。當金屬離子為硫酸鎂時，0D6QQ值和抑菌率也顯著提高，當金屬離子為硫 酸錳、氯化鈉時，其〇D_值較對照降低了，但其抑菌率較對照提高了。添加 FeS04和ZnS04的培 養基，TWC2菌株不生長，說明這兩種金屬離子強烈抑制TWC2的生長。因此氯化鈣作為優化培 養基的最佳金屬離子。
[0057] 表5TWC2菌株在不同金屬離子條件下的生長情況 [0058:
[0059] 4.2.4培養基組分配比優化
[0060]根據最佳碳源、氮源和金屬離子的篩選結果，通過正交實驗設計，選用5因素4水平 L16(45)正交表確定各組分的最佳配比，以確定適宜TWC2菌株生長和產抗菌物質的優化培養 基的最佳組合。
[0061] 通過正交實驗設計對篩選到的最佳碳源、氮源和金屬離子進行優化，結合TWC2抑 菌活性，最終確定TWC2的最優培養基。其組分含量為:麥芽糖5g/L，果糖10g/L，蛋白胨10g/ L，酵母浸出1 Og/L，氯化f丐1 g/L。
[0062] 表6TWC2菌株在不同培養基條件下的生長情況
[0063]
[0064] 4.2.5最佳培養條件的篩選
[0065] 在確定最優培養基后，從pH、溫度、裝液量、時間、接種量和轉速等方面進一步對 TWC2的最佳培養條件進行了篩選.。
[0066] ① PH值
[0067] 采用0.1mol/L HC1和0.1mol/L NaOH調節優化培養基pH值。分別將pH值為4.0、 5 ·0、5·5、6· 0、6·5、7·0、7 ·5、8·0、9· 0、10.0 的優化培養基100ml 裝入250ml 三角瓶中，121°C 滅菌20min，冷卻后接種lmL TWC2種子液，37°C、180rpm/min培養48h。
[0068] 結果表明，在pH值為5.0~9.0時，TWC2菌株的0D值和抑菌率差異不顯著，pH值小于 4.0或者大于10.0均不利于菌株的生長及抑菌物質的產生。因此，培養最佳范圍為5.0~ 9.0，最適pH值為6.0 (結果見表7)。
[0069] 表7TWC2菌株在不同pH的生長情況
[0070]
[0071 ]②菌株生長最適溫度
[0072] 在250ml三角瓶中裝優化培養基為100mL，121°C滅菌20min。接種量為每個搖瓶中 接種lmL TWC2種子液，分別在 10°C、15°C、20°C、24°C、26°C、28°C、30°C、32°C、34°C、37°C、40 °C，180rpm/min條件下培養48h。試驗表明，該菌株在10~40°C均能生長，顯著差異。當溫度 范圍為26~40 °C，菌株0D600值在0.648~0.846,抑菌率為61.814~67.303。最適溫度為34 。(：，其0D值和抑菌率均為最大，分別達到0.985，69.928 % (結果如表8)。
[0073] 表8TWC2菌株在不同溫度條件的生長情況
[0074] 12 2 ③通氣量
[0077] 在 250mL 三角瓶中分別裝入體積為 20mL、40mL、60mL、80mL、100mL、120mL、140mL、 160mL的優化培養基，121°C滅菌20min。接種量為每個搖瓶中接種lmL TWC2種子液，于37°C、 180rpm/min條件下培養48h。結果表明，當裝液量為40mL時，菌株生長最佳，0D 6(x)值為1.126， 抑菌率為56.038% (結果見表9)。裝液量多于或小于40mL，其0D值和抑菌率均有所降低。因 此，在搖瓶發酵時，裝液量過多或者過少均不利于菌株的生長及抑菌物質的產生，在250mL 三角瓶中，最佳裝液量應為40mL。
[0078] 表9TWC2菌株在不同通氣量條件的生長情況
[0079]
[0080] ④培養時間
[00811 250mL三角瓶中裝優化培養基為100mL，121°C滅菌20min。接種量為每個搖瓶中接 種lmLTWC2種子液，于37°C、180rpm/min下將TWC2菌株的培養時間分別調節為12h、24h、36h、 4811、6011、7211、8411、9611、12011。結果表明，當培養時間為4811時生長最佳，006()()值0.590，抑菌 率為67.064 (結果見表10)，隨著培養時間的增加，OD600值先增加后降低，可能是由于培養 時間過長，培養液的營養消耗過多，從而使0D值降低。
[0082]表10TWC2菌株在不同培養時間條件的生長情況
[0083]
[0084]⑤接種量
[0085] 250mL三角瓶中裝優化培養基為100mL，121°C滅菌20min。將TWC2種子液的接種量 (乂八)分別調節為1%、3%、5%、7%、9%，于37°(：、180印111/1^11條件下培養4811。結果發現， 0D6QQ值大小依次為7 % >9 % >5 % >3 % >1 %，抑菌率大小依次為7 % >3 % >5 % >9 % >1 %，由此 可知，當接種量為7%時，菌株生長和產抑菌物質最佳(結果見表11)。
[0086] 表11TWC2菌株在不同接種量條件的生長情況
[0088] 似將 ?[0089] 250mL三角瓶中裝優化培養基為100mL，121°C滅菌20min。接種量為每個搖瓶中接 種lmL TWC2種子液，于37°C 下，將搖床轉速分別調為 120rpm/min、160rpm/min、180rpm/min、 200rpm/min、220rpm/min條件下培養48 h。結果表明，當菌株在轉速為200rpm/min時，菌株 生長和抑菌率均為最佳(結果見表12)。[0090] 表12TWC2菌株在不同轉速條件的生長情況
[0087]
[0091]
[0092]⑥致死溫度的測定
[0093]將TWC2菌株接入發酵培養基，180rpm/min，28°C培養24h，然后分裝于試管中，每管 1 OmL，分別置于溫度50 °C、60 °C、70 °C、80 °C、90 °C、99 °C (水浴鍋溫度達不到100 °C)的水浴鍋 中lOmin，然后涂平板，24h后觀察菌落生長情況。結果顯示，菌株在50~90°C均能正常生長， 99°C不能生長。根據上述結果，再設一組溫度:91°C、92°C、93°C、94°C、95°C、96°C、97°C、98 °C，24h后觀察菌落生長情況。結果表明，該菌株的致死溫度為98°C，10min.(見圖4)。
[0094] 5.解淀粉芽孢桿菌TWC2的抗生素抗性
[0095]測定了 TWC2對氨芐青霉素，四環素，鏈霉素，卡那霉素，利福平，頭孢霉素，氯霉素 的抗性反應。將上述抗生素溶解在蒸餾水或乙醇中，配制成適當濃度的溶液，過濾法滅菌后 備用。將菌株接入LB培養基制成含菌平板，以無菌鑷子取含抗生素的紙片于平板上，置34°C 培養箱培養，24小時后觀察菌株生長情況。結果發現，TWC2菌株對上述抗生素均具有抗性 (見圖5)
[0096] 6.解淀粉芽孢桿菌TWC2對熱帶作物常見病原真菌的拮抗作用檢測
[0097] 將TWC2分別與不