銅綠假單胞菌突變株構建方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本申請涉及基因工程突變菌，特別是銅綠假單胞菌基因工程突變菌，尤其是銅綠 假單胞菌外毒素 A減毒株，還涉及其制備方法以及該突變菌或減毒株在制備疫苗或輔助治 療藥中的應用。
【背景技術】
[0002] 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa, Pa)又稱綠膿桿菌，是一種需氧型的革 蘭氏陰性菌，無芽胞，有數根菌毛和單一端生鞭毛，廣泛分布于土壤、水、空氣、正常人的皮 膚、呼吸道和腸道中。該菌是一種條件致病菌，只在某種特定條件下才能致病。由于機體抵 抗力降低，被嚴重燒傷或患代謝性疾病、血液病、惡性腫瘤的患者，以及術后或某些治療后 的患者比較容易感染該菌。
[0003] 許多重癥病人因其免疫力低下經常發生嚴重的綠膿桿菌感染并發癥，臨床表現 為肝、腎、肺細胞壞死、腎出血、脂肪性變、低血壓性休克等，其中以肝細胞壞死最為嚴重。 1972年，P. V. Liu在臨床分離株的培養液中，發現了導致綠膿桿菌感染的毒性因子-外 毒素 A，并指出綠膿桿菌外毒素 A (PEA)對皮膚粘膜有壞死作用，進入血液中能誘發敗 血癥。在臟器組織細胞中，綠膿桿菌外毒素 A與白喉毒素類似，具有阻礙蛋白質合成的 作用；小鼠和大鼠對其敏感性高，具有致死作用；對培養細胞有"細胞崩壞毒性" [Yates S P，Merrill AR. Elucidation of eukaryotic elongation factor-2 contact sites within thecatalytic domain of Pseudomona aeruginosa exotoxin A.The Biochemical Journal，2004, 379 :563~572.]。研究人員在之后更加深入的研究中發現，綠膿桿菌的多 種菌體成分和產物（內毒素、外膜蛋白、纖毛、堿性蛋白酶、細胞外酶S、磷脂酶C、彈性蛋白 酶、外毒素 A、殺白細胞素、溶血酶等）在其致病性中起著不同的作用。大多數革蘭氏陰性菌 的內毒素毒性較強，而綠膿桿菌恰恰相反，其外毒素 A的毒性最強，是其分泌的一種毒力很 強的致死性外毒素 （Hwang J，1987)，已被國內外學者證實它是引起感染的內在機制，是最 主要的致病因子之一。
[0004] 傳統的細菌疫苗多注重在刺激宿主產生抗體，以對抗病原菌或加強巨噬細胞的噬 菌能力，進而阻止細菌在患者體內繁衍。綠膿桿菌外毒素 A是綠膿桿菌致病的最重要的內 在機制，嚴重感染綠膿桿菌但能夠存活下來的患者，其體內的抗綠膿桿菌外毒素 A抗體的 濃度都很高；因感染而死亡的患者，其體內卻含有較低濃度的抗綠膿桿菌外毒素 A抗體。此 外，免疫力低下的患者可以通過使用抗綠膿桿菌外毒素 A抗體使自己免受綠膿桿菌感染的 威脅。但是綠膿桿菌外毒素 A的毒性很強，如何利用基因工程方法降低或消除PEA的毒性， 發展更安全、有效的綠膿桿菌疫苗，是科學家的研究重點之一。
[0005] 以往消除PEA毒性都是用福爾馬林處理，使其蛋白變性，制成沒有毒性的類毒素。 再用類毒素免疫家兔，產生免疫應答后取兔血，血清即為抗PEA抗體。這種減毒方法仍有可 能產生有害的毒素。因此就有科學家利用基因工程的技術讓綠膿桿菌外毒素 A的毒性消 失，但仍然保留大部分抗原性，而成為無毒性的綠膿桿菌外毒素 A類毒素。利用這種類毒 素，可以有效刺激機體產生抗體，中和綠膿桿菌外毒素 A的毒害作用。這比先前用福爾馬林 處理綠膿桿菌外毒素 A制造類毒素疫苗的傳統方法更安全，而且抗原性也較強。
[0006] PEA蛋白既有B細胞表位，又有T細胞表位，能誘導良好的體液免疫和細胞免疫，是 極有希望的疫苗候選分子。研究和開發Pa疫苗，對于預防和治療Pa感染具有十分重要的 意義。它不僅可作為疫苗蛋白，也是一種重要的疫苗佐劑和疫苗載體。然而由于天然PEA 的細胞毒性較強，不能直接作為疫苗佐劑和載體應用于疫苗的生產，必須通過基因工程方 法對其進行基因改造使其毒性降低或完全脫毒才能應用。
[0007] 有報道表明，Lys57、His246、Arg247、His249、Arg279、Glu553 等一些位點（由于 先前報道的PEA有613個氨基酸，而目前b報道的PEA蛋白的全長是638個氨基酸（參見 SEQ ID N0:1)，因此這些位點分別對應于 SEQ ID N0:1 的 Lys82、His271、Arg272、His274、 Arg304、Glu578)對于PEA的生物活性都是很重要的。已有研究得出，PEA中第553位 (對應于SEQ ID N0 :1中的第578位）Glu缺失或突變得到的突變體，不僅細胞毒性明顯 降低，而且其免疫原性很好，可作為疫苗的備選者[Douglas CM, Collier RJ.Exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa ：substitution of glutamic acid553with aspartic acid drastically reduces toxicity and enzymatic activity. J Bacteriol. 1987,169(11)： 4967~4971.]。然而，由于無法或者非常難以實現在該菌的基因組上完成定點突變，故尚 未獲得綠膿桿菌外毒素 A減毒的減毒菌株。本發明人通過研究，建立了在該菌的基因組上 完成定點突變的方法，構建成了綠膿桿菌外毒素 A的基因工程減毒菌株。
[0008] 綠膿桿菌本身可以用于疫苗治療綠膿桿菌感染的疫苗，也可以用作輔助治療劑。 綠膿桿菌-甘露糖敏感血凝（PA-MSHA)菌毛株疫苗常被稱作"綠膿桿菌制劑"，是一種能全 面提高及調整癌癥患者的體液免疫和細胞免疫功能，增強抑制和殺傷癌細胞效應的新型細 菌性免疫調節劑（或稱PA-MSHA免疫調節劑），是癌癥患者理想的輔助治療藥物。這種疫苗 常被用作急性白血病、惡性淋巴瘤、肺癌的輔助治療藥物，在乳腺癌的治療上也取得了很好 的療效（鄭秀萍，2010 ;陳衛東，2009)。
[0009] 此外，英國研制出一種用于治療綠膿桿菌感染的口服型疫苗。通過成人志愿者小 人群臨床試驗證明，口服接種免疫后，血清IgA水平提高并能促進機體產生并增強吞噬綠 膿桿菌的能力，口服適宜劑量的此疫苗在人體內是安全的并且具有免疫原性。此疫苗還有 望治療纖維囊腫病人，消除這些病人肺部寄生的綠膿桿菌，避免呼吸衰竭而導致的死亡。
【發明內容】
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[0010] 本發明的一個目的是對Pa外毒素 A抗原編碼基因 toxA進行突變，使其毒性降低 或消失，但不影響其抗原特性。通過對Pa基因組toxA基因進行修飾，得到基因工程外毒素 A減毒株，從而為Pa感染的免疫預防開辟了新的方向。
[0011] 因此，本發明涉及銅綠假單胞菌突變株、特別是銅綠假單胞菌外毒素 A蛋白突變 株、制備基因工程突變菌的方法，還涉及含有所述銅綠假單胞菌突變株的疫苗、以及用所述 疫苗治療銅綠假單胞菌感染的方法及其應用。
[0012] 特別是，本發明涉及：
[0013] 1.銅綠假單胞菌，其中外毒素 A蛋白已被減毒，優選外毒素 A蛋白中選自以下位置 的氨基酸突變或缺失：
[0014] 對應于 SEQ ID NO :1 的 Lys82、His271、Arg272、His274、Arg304、Glu578。
[0015] 2.權利要求1的銅綠假單胞菌，其中其外毒素 A蛋白中對應于SEQ ID N0:1的 Glu578突變或缺失。
[0016] 3.上述2的銅綠假單胞菌，其中其外毒素 A蛋白中對應于SEQ ID NO :1的Glu578 突變為Asp。
[0017] 4.上述2的銅綠假單胞菌，其中其外毒素 A蛋白中對應于SEQ ID NO :1的Glu578 缺失。
[0018] 5.制備基因工程突變菌的方法，包括：
[0019] (1)從細菌基因組中的待突變基因擴增第一片段和第二片段，所述第一片段含有 從該基因第一端至突變位點前的序列，而第二片段含有該基因另一端編碼區之外的序列， 例如第一片段為該基因中突變位點前的上游序列，而第二片段為該基因編碼區之后的序 列，或者第一片段為該基因中突變位點之后的下游序列，而第二片段為該基因編碼區之前 的序列；
[0020] (2)將第一片段和