第二片段插入轉移載體中，所述轉移載體優選能通過細菌間基 因轉移、更優選通過細菌間接合轉移而從供體菌轉移到受體菌，所述轉移載體含有第一抗 性基因和第二抗性基因，并且第一抗性基因兩側帶有同源重組位點LoxP，第一片段和第二 片段插入到LoxP-第一抗性基因-LoxP兩側用作同源臂，構建缺失載體，所述載體例如為質 粒；
[0021] (3)通過設計在突變位點帶有突變的引物，經由PCR擴增引入所述突變，將含有從 基因第一端至突變位點前的（例如上游序列或下游序列）、突變位點的所述突變以及突變 位點后到基因另一端（例如終止子）的序列（例如下游序列或上游序列）的序列，利用同 源重組，將其插入到所述轉移載體中，替換轉移載體中第一抗性基因和一個loxP位點，構 建突變載體；
[0022] (4)將能促進細菌間基因轉移、優選細菌間接合轉移的輔助菌、作為供體菌的含 有缺失載體的細菌和作為受體菌的待突變細菌一起培養，篩選通過同源重組而具有第一抗 性但無第二抗性的第一重組子，第一重組子在帶突變基因中自突變位點至終止子的序列被 LoxP-第一抗性基因-LoxP所取代，其中所述輔助菌優選能促進細菌間接合轉移的細菌，更 優選含有質粒PRK2013的大腸桿菌，如大腸桿菌HB101 ;
[0023] (5)將能促進細菌間基因轉移的輔助菌、作為供體菌的含有待轉移的突變載體的 細菌和作為受體菌的第一重組子一起培養，篩選以突變位點前的上游序列作為同源臂、通 過同源重組經過單雜交而產生的具有第二抗性而無第一抗性的第二重組子，第二重組子含 有帶有所述突變的完整的突變基因并且含有整個突變載體，其中所述輔助菌優選能促進細 菌間接合轉移的細菌，更優選大腸桿菌HB101 (pRK2013);
[0024] (6)將帶有第三抗性基因的Cre表達載體引入第二重組子中，篩選具有第三抗性 而無第一抗性和第二抗性的第三重組子，在第三重組子中慶大霉素抗性和四環素抗性這兩 個抗性基因以及其他的載體序列通過重組已被缺失；
[0025] (7)培養第三重組子，選擇丟失了 Cre表達載體的第三抗性為陰性的菌株，得到所 述基因被突變的基因工程菌，
[0026] 所述基因工程突變菌優選為銅綠假單胞菌，更優選為外毒素 A蛋白減毒菌。
[0027] 6.上述5的方法，其中所述基因工程突變菌為銅綠假單胞菌，其外毒素 A蛋白已被 減毒，優選外毒素 A蛋白中選自以下位置的氨基酸突變或缺失：
[0028] 對應于 SEQ ID N0 :1 的 Lys82、His271、Arg272、His274、Arg304、Glu578。
[0029] 7.用上述5或6的方法制備的銅綠假單胞菌基因工程減毒菌，所述減毒菌優選為 外毒素 A蛋白減毒菌。
[0030] 8.銅綠假單胞菌外毒素 A蛋白，所述蛋白是從上述1-4中任一項的銅綠假單胞菌 或上述7的銅綠假單胞菌基因工程減毒菌中分離的。
[0031] 9.疫苗，其包含上述1-4中任一項的銅綠假單胞菌或上述7的銅綠假單胞菌基因 工程減毒株或上述8的銅綠假單胞菌外毒素 A蛋白。
[0032] 10.上述1-4中任一項的銅綠假單胞菌或上述7的銅綠假單胞菌基因工程減毒株 或上述8的銅綠假單胞菌外毒素 A蛋白在制備疫苗中的用途。
[0033] 11.上述10的用途，其中所述疫苗用于治療銅綠假單胞菌感染。
[0034] 12.上述10的用途，其中所述疫苗用作免疫調節制劑。
[0035] 13.上述10的用途，其中所述疫苗用作癌癥的輔助治療藥物。
【附圖說明】
[0036] 圖1顯示缺失質粒的構建。
[0037] 圖2顯示突變質粒的構建。
[0038] 圖3為pCM158質粒圖譜。
[0039] 圖4顯示缺失質粒中的慶大霉素抗性基因經雙雜交整合到基因組中。
[0040] 圖5顯示完整的突變質粒載體經過單雜交整合到攜帶有慶大霉素抗性基因的基 因組中。
[0041] 圖6顯示完整的突變質粒載體經過單雜交整合到攜帶有慶大霉素抗性基因的基 因組中。
[0042] 圖7為在基因組上進行ToxA定點突變基因修飾的全流程圖。
【具體實施方式】
[0043] 本發明人通過深入的研究，建立了制備基因工程突變菌的方法。下文以構建對應 于中Glu533突變為Asp的銅綠假單胞菌外毒素 A減毒株為例，詳細說明基因工程突變菌的 構建。
[0044] 第一步構建缺失質粒載體（見圖1)
[0045] 從銅綠假單胞菌PA01 (購自美國典型培養物保藏中心（American type culture collection)，保藏號為ATCC15692)。從基因組上擴增ToxA基因的兩個片段，使用引物對 P1/P2擴增ToxA-3'，使用引物對P3/P4擴增after ToxA，ToxA-3'是位于ToxA自突變位點 前的序列，after ToxA是ToxA編碼區后面的序列。它們分別為614bp和514bp，用作同 源臂，用于整合慶大霉素抗性（gentaR)基因到銅綠假單胞菌染色體上。此步驟中人為設計 缺失ToxA自突變位置向基因下游直至ToxA基因的終止密碼子的C端序列，目的是為通過 后面的雙雜交整合或雙交換（double crossover)途徑將ToxA基因的兩個片段ToxA-3'和 after ToxA及其中間的慶大霉素抗性基因的篩選作用被整合到銅綠假單胞菌的基因組中。
[0046] 原始質粒pCM351 (由歐洲分子生物學實驗室付軍博士惠贈 ；N Dubarry，W Du, D Lane, F Pasta. Applied and environmental microbiol ogy,2010,76(4) :1095-1102)是 一種轉移質粒或接合質粒，該質粒上的慶大霉素抗性基因兩側事先已經被構建了兩個loxP 位點的。用限制性內切酶EcoR I和Nco I酶切質粒pCM351，使其線性化。通過同源重組 方法，例如使用深圳市中聯生物科技開發有限公司的基因克隆試劑盒（Invitro reaction cloning kit)、基因克隆試劑盒（Invitro reaction cloning kit)，將 ToxA-3' 片段整合 到質粒pCM351中的loxP-gentaR-loxP-側的EcoR I和Nco I位點；再用同源重組的方法 將 after ToxA 插入到質粒 pCM351 中 loxP-gentaR-loxP 另一側的 SnaB I 和 Age I 位點， 構建缺失載體 pCM351-toxA_deletion。
[0047] 第二步構建突變質粒載體（見圖2)
[0048] 設計PCR引物對P5/P6和P7/P8,其中引物P6和P7帶有突變位點，經由PCR擴 增引入突變。利用同源重組（使用基因克隆試劑盒（In vitro reaction cloning kit)) 將突變位置前614bp的序列和突變點，以及突變位置后到終止子的序列整合到pCM351質 粒EcoR I酶切位點，替換掉pCM351質粒上的GentaR和一個loxP位點，構建突變載體 pCM351-toxA_mutation。所述614bp的序列用作同源臂，以整合質粒到染色體。
[0049] 第三步整合gentaR基因到染色體（見圖4)
[0050] 讓輔助菌、作為供體菌的大腸桿菌pCM351-toxA-deletion和作為受體菌的PA01 進行三體交配（即三體雜交或三親接合轉移）。所述的輔助菌能促進細菌間基因轉移（從供 體菌轉移到受體菌），例如促進細菌間接合轉移。所述的輔助菌例如為含有質粒PRK2013 的大腸桿菌（E. coli)(張鵬翼.雙選擇抗生素影響大腸桿菌間質粒接合轉移的分子機制暨 纖維堆囊菌S〇0157-2表達蛋白質組學分析，山東大學，2010)，例如大腸桿菌HB101。輔助 菌能夠促進轉移載體（例如質粒，如質粒PCM351和所述缺失質粒）從供體菌轉移到受體菌 中。當缺失質粒被轉入受體菌后發生重組反應。菌體染色體組中發生的重組反應有單雜 交整合或單交換（single crossover)和雙雜交整合或雙交換（double crossover)兩個途 徑。雙雜交整合的產物是只有慶大霉素抗性的菌株，通過引物P9/