P10和P11/P12經PCR檢 測確認雙雜交整合；單雜交整合由于是全質粒整合，故其產物不僅有慶大霉素抗性，還有四 環素抗性。因此通過利用三體交配（即三體雜交或三親接合轉移），篩選僅有慶大霉素抗性 而無四環素抗性的菌株，獲得了通過雙雜交整合重組途徑而產生的、其中導入了缺失載體 的重組子（見圖4)。
[0051] 第四步整合突變位點到染色體上（見圖5)
[0052] 該步驟的目的是將包含慶大霉素和四環素抗性的完整的質粒整合到染色體組。通 過三體雜交技術，通過單雜交整合導入突變載體pCM351-toxA_mutation，即通過614bp的 同源臂，將ToxA自突變位置后的C端序列，包括選擇性四環素（tet)抗性基因在內的整合 整個質粒整合到染色體組中（見圖5)。簡而言之，通過讓輔助菌、含有突變質粒（作為轉移 質粒）的供體菌和作為受體菌的在上述第四步中獲得的導入了缺失載體的重組子進行三 體雜交，篩選具有四環素抗性的、通過單雜交整合導入突變載體pCM351-toxA-mutation的 重組子。然后通過引物P13/P14、P15/P16、P17/P18經PCR檢測確認。
[0053] 第五步消除抗性基因（見圖3和6)
[0054] Cre重組酶是一種位點特異性重組酶，能介導兩個34bp的LoxP位點之間的特異性 重組，使LoxP位點間的DNA序列被缺失或倒位。LoxP由兩個13bp的反向重復序列和8bp 的中間間隔序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了 LoxP的方向，如果兩個LoxP位點 位于一條DNA鏈上，且方向相同，則Cre重組酶能有效地使兩個LoxP位點間的序列和其中 的一個LoxP位點缺失，在原位點上只留下一個LoxP。
[0055] 將含有卡那霉素抗性基因的Cre表達載體pCM158 (CJ Marx, ME Lidstrom. Biotechniques, 2002, 33 :1062-1067)經電轉導入上述第五步中通過單雜交整合導入了突 變載體pCM351-toxA_mutation的重組子（見圖3)。通過卡那霉素（kan)抗性篩選重組子。 在卡那霉素（kan)抗性重組子中誘導Cre蛋白發生重組缺失，從而使慶大霉素抗性和四環 素抗性這兩個抗性基因以及其他的載體序列缺失，最后在toxA基因下游留下一個ΙοχΡ位 點。經雙平板劃線法選擇四環素（tet)和慶大霉素（genta)陰性克隆（見圖6)，然后通過 引物P19/P20 PCR檢測確認。
[0056] 第六步丟失pCM158質粒
[0057] 于30°C培養上述四環素（tet)和慶大霉素（genta)陰性細菌，選擇丟失了 Cre表 達載體PCM158的卡那霉素（kan)陰性菌株，得到toxA突變的PA01菌株。克隆ToxA突變 體到克隆載體，然后經測序確以。
[0058] 表1為以上所用引物一覽表。
[0059] 表 1
[0060]
[0061]
[0062] 圖7歸納了在銅綠假單胞菌基因組上進行ToxA定點突變基因修飾的全流程圖。
[0063] 實施例
[0064] 實施例1.銅綠假單胞菌外毒素 A蛋白Glu578Asp突變株和Glu578缺失突變株的 制備
[0065] 按照以上所述的第一步至第六步的描述，制備了銅綠假單胞菌外毒素 A蛋白 Glu578Asp突變株，其中三親雜交按照下述步驟進行：
[0066] (1)供體菌大腸桿菌（toxA)和輔助菌大腸桿菌HB101 (pRK2013)(由山東大學微生 物技術國家重點實驗室王海龍博士惠贈）在含Kan20 μ g/mL的LB平板固體培養基上劃線 活化，培養16_18h，然后接單個菌落到Kanl5 μ g/mL的3ml LB液體培養基中，37°C培養過 夜，生長到對數期。
[0067] (2)受體菌銅綠假單孢菌PA01 (購自美國典型培養物保藏中心（American type culture collection)，保藏號為ATCC15692)在LB平板固體培養基上劃線活化，28-30°C培 養過夜，然后接種單菌落到3mlLB液體培養基中，28°C振蕩培養過夜，至對數期。
[0068] (3)將供體菌大腸桿菌（toxA)、輔助菌大腸桿菌HB101 (pRK2013)和受體菌銅綠假 單胞菌PA01這三種菌的培養物各取lml，離心，用300 μ 1新鮮LB重懸，各取50 μ 1滴在LB 固體平板的中間，混勻，晾干。
[0069] (4)371：溫育411，然后轉移至28-301：培養過夜。
[0070] (5)在LM和ΡΜΜ培養基上篩選突變菌株。
[0071] 另外，按照上述方法，用引物Ρ21代替引物Ρ6、用引物Ρ22代替引物Ρ7,制備了銅 綠假單胞菌外毒素 Α蛋白Glu578缺失突變株。
[0072] 實施例2.毒性試驗
[0073] (1)細胞毒性試驗
[0074] 用MTT法測定重組PEA(Glu578Asp突變蛋白）和親本PEA蛋白的細胞毒性。從銅 綠假單胞菌外毒素 A蛋白Glu578Asp突變株和銅綠假單胞菌P0A1分別分離純化重組PEA 和親本PEA蛋白。將保存于-80°C的重組PEA和親本PEA蛋白融化，測定蛋白的含量，確定 好蛋白的濃度后用于下一步的細胞毒性實驗。實驗共三個梯度，即250 μ g/孔、325 μ g/孔、 500 μ g/孔。將L929細胞傳代于96孔板中，當細胞密度達到70%滿度時，換含2%血清的 DMEM培養基，同時加入DMEM溶解的各個梯度的重組PEA或親本PEA蛋白處理貼壁的L929 細胞，并用相同濃度的BSA處理L929細胞做空白對照。37°C二氧化碳培養箱中培養2天后 取出，加入MTT液繼續培養4h，吸除原液，加入DMS0,震蕩lOmin，用酶聯免疫檢測儀在波長 為570nm下測定其吸光度值，根據公式RGR(% )=(試驗組吸光度值/空白對照組吸光度 值）X100%計算細胞的相對增值度（RGR)。根據細胞增值度評定細胞毒性反應，細胞毒性 分級標準見表1，試驗結果見表2。MTT法測PEA蛋白細胞毒性結果表明，重組PEA毒性較親 本PEA顯著降低，在最高劑量500 μ g/孔，培養2天仍然沒有明顯的細胞毒性。
[0075] 表2.細胞毒性反應評定
[0076]
[0077] 表3.細胞相對增值度PGR及評級
[0078]
[0079] (2)動物毒性試驗
[0080] 取50只小鼠，隨機分成5組，每組10只小鼠，分別經腹腔注射5種不同劑量的PEA 蛋白。5個試驗組的PEA注射劑量依次為：lmg/10g體重、5mg/10g體重、10mg/10g體重、 15mg/10g體重、20mg/10g體重，注射后觀察2周。注射重組PEA蛋白（Glu578Asp突變蛋白） 的在20mg/10g劑量組第3天有1只小鼠死亡，其余組小鼠均無異常反應；注射親本PEA蛋 白的10mg/10g劑量組，在第1天有2只小鼠死亡，第2天有3只小鼠死亡，第三天4只小鼠 死亡；15mg/10g劑量組，在第1天有3只小鼠死亡，第2天有3只小鼠死亡，第三天4只小 鼠死亡20mg/10g劑量組，在第1天有10只小鼠死亡。
[0081] 銅綠假單胞菌外毒素 A減毒株的應用：
[0082] 銅綠假單胞菌外毒素 A減毒株可以被制成注射針劑和口服兩種劑型的活菌疫苗。 注射針劑型活菌疫苗可用于對人、家畜（如：豬、牛、羊）、家禽（雞、鴨、鵝）、寵物以及經濟 類動物等進行免疫接種。也可以采取物理和化學等方法使其滅活，并經過多次清洗、離心及 純化等手段制成菌苗進行免疫接種，從而使這些被接種的人或動物具有后天對銅綠假單胞 菌的免疫，不僅如此存在大量實驗證明這個活菌苗可以是一種優異的免疫制劑可以明顯提 高被免疫動物的免疫力，對廣泛的革蘭氏陰性菌和病毒都具有很強的免疫調節作用。
[0083] 銅綠假單胞菌外毒素 A減毒株可以作為食品添加劑（如：加入牛奶、酸奶等乳制 品中）、口服性疫苗、也可使用腸溶膠囊進行包裹或者作為動物飼料的添加劑，通過其在人 或動物的消化系統中微生態環境中生存，并對消化系統絨毛上皮的粘附作用，完成免疫作 用，這種非侵入行的免疫接種無論是對于人還是動物都是一個非常好而可取的免疫接種手 段。