[0084] 銅綠假單胞菌外毒素 A減毒株可以被制成噴劑，用于人或者動物的上呼吸道的免 疫接種；也可以被制成腸溶性栓劑，用于人或者動物的直腸部位給藥進行免疫接種。
[0085] 銅綠假單胞菌外毒素 A減毒株可以被制成綠膿桿菌免疫調節制劑在癌癥的新輔 助免疫治療中的使用。
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【主權項】
1. 銅綠假單胞菌，其中外毒素 A蛋白已被減毒，優選外毒素 A蛋白中選自以下位置的氨 基酸突變或缺失： 對應于 SEQ ID N0:1 的 Lys82、His271、Arg272、His274、Arg304、Glu578。2. 權利要求1的銅綠假單胞菌，其中其外毒素 A蛋白中對應于SEQ ID NO :1的Glu578 突變或缺失。3. 權利要求2的銅綠假單胞菌，其中其外毒素 A蛋白中對應于SEQ ID NO :1的Glu578 突變為Asp。4. 權利要求2的銅綠假單胞菌，其中其外毒素 A蛋白中對應于SEQ ID NO :1的Glu578 缺失。5. 制備基因工程突變菌的方法，包括： (1) 從細菌基因組中的待突變基因擴增第一片段和第二片段，所述第一片段含有從該 基因第一端至突變位點前的序列，而第二片段含有該基因另一端編碼區之外的序列，例如 第一片段為該基因中突變位點前的上游序列，而第二片段為該基因編碼區之后的序列，或 者第一片段為該基因中突變位點之后的下游序列，而第二片段為該基因編碼區之前的序 列； (2) 將第一片段和第二片段插入轉移載體中，所述轉移載體優選能通過細菌間基因轉 移、更優選通過細菌間接合轉移而從供體菌轉移到受體菌，所述轉移載體含有第一抗性基 因和第二抗性基因，并且第一抗性基因兩側帶有同源重組位點LoxP，第一片段和第二片段 插入到LoxP-第一抗性基因-LoxP兩側用作同源臂，構建缺失載體，所述載體例如為質粒； (3) 通過設計在突變位點帶有突變的引物，經由PCR擴增引入所述突變，將含有從基因 第一端至突變位點前的（例如上游序列或下游序列）、突變位點的所述突變以及突變位點 后到基因另一端（例如終止子）的序列（例如下游序列或上游序列）的序列，利用同源重 組，將其插入到所述轉移載體中，替換轉移載體中第一抗性基因和一個loxP位點，構建突 變載體； (4) 將能促進細菌間基因轉移、優選細菌間接合轉移的輔助菌、作為供體菌的含有缺 失載體的細菌和作為受體菌的待突變細菌一起培養，篩選通過同源重組而具有第一抗性 但無第二抗性的第一重組子，第一重組子在帶突變基因中自突變位點至終止子的序列被 LoxP-第一抗性基因-LoxP所取代，其中所述輔助菌優選能促進細菌間接合轉移的細菌，更 優選含有質粒PRK2013的大腸桿菌，如大腸桿菌HB101 ; (5) 將能促進細菌間基因轉移的輔助菌、作為供體菌的含有待轉移的突變載體的細菌 和作為受體菌的第一重組子一起培養，篩選以突變位點前的上游序列作為同源臂、通過同 源重組經過單雜交而產生的具有第二抗性而無第一抗性的第二重組子，第二重組子含有帶 有所述突變的完整的突變基因并且含有整個突變載體，其中所述輔助菌優選能促進細菌間 接合轉移的細菌，更優選大腸桿菌HB101 (pRK2013); (6) 將帶有第三抗性基因的Cre表達載體引入第二重組子中，篩選具有第三抗性而無 第一抗性和第二抗性的第三重組子，在第三重組子中慶大霉素抗性和四環素抗性這兩個抗 性基因以及其他的載體序列通過重組已被缺失； (7) 培養第三重組子，選擇丟失了 Cre表達載體的第三抗性為陰性的菌株，得到所述基 因被突變的基因工程菌， 所述基因工程突變菌優選為銅綠假單胞菌，更優選為外毒素 A蛋白減毒菌。6. 權利要求5的方法，其中所述基因工程突變菌為銅綠假單胞菌，其外毒素 A蛋白已被 減毒，優選外毒素 A蛋白中選自以下位置的氨基酸突變或缺失： 對應于 SEQ ID N0:1 的 Lys82、His271、Arg272、His274、Arg304、Glu578。7. 用權利要求5或6的方法制備的銅綠假單胞菌基因工程減毒菌，所述減毒菌優選為 外毒素 A蛋白減毒菌。8. 銅綠假單胞菌外毒素 A蛋白，所述蛋白是從權利要求1-4中任一項的銅綠假單胞菌 或權利要求7的銅綠假單胞菌基因工程減毒菌中分離的。9. 疫苗，其包含權利要求1-4中任一項的銅綠假單胞菌或權利要求7的銅綠假單胞菌 基因工程減毒株或權利要求8的銅綠假單胞菌外毒素 A蛋白。10. 權利要求1-4中任一項的銅綠假單胞菌或權利要求7的銅綠假單胞菌基因工程減 毒株或權利要求8的銅綠假單胞菌外毒素 A蛋白在制備疫苗中的用途。11. 權利要求10的用途，其中所述疫苗用于治療銅綠假單胞菌感染。12. 權利要求10的用途，其中所述疫苗用作免疫調節制劑。13. 權利要求10的用途，其中所述疫苗用作癌癥的輔助治療藥物。
【專利摘要】本申請涉及銅綠假單胞菌基因工程突變菌，尤其是銅綠假單胞菌外毒素A減毒株，還涉及其制備方法以及該突變菌或減毒株在制備疫苗或輔助治療藥中的應用。
【IPC分類】C12N15/74, C12R1/385, C07K14/21, A61P37/02, A61P35/00, C12N1/21, A61P31/04, A61K39/104
【公開號】CN105647841
【申請號】
【發明人】蘇靜, 符軍, 陳敏文
【申請人】蘇靜
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年9月4日