培養12h，用酶標儀測 定菌液0D6QQ。將0D 6QQ小于0.15的點對應的抗生素濃度定義為菌株對多粘菌素的MIC值。同 時，做這兩種抗生素的抑菌圈實驗，l〇ug的抗生素點涂到平板的濾紙片上，突變株對多粘菌 素的抗性均減弱。其中圖5為抑菌圈的實驗結果，有圖5可知，由抑菌圈的大小反應對這兩種 抗生素的抗性，抑菌圈越大，說明菌對抗生素的抗性越低，菌越容易被殺死。圖中顯示ESA-02008 突變株的抑菌圈比 pH 5.0條件下野生型菌株的抑菌圈要小， 也就是其抗性減弱。 [0053] 野生型和突變菌在不同pH下對陽離子抗性肽的MIC值結果如表1所示。結果表明 ESA-02008突變株對陽離子抗性肽的抗性降低。
[0054]表1野生型和突變菌在不同pH下對陽離子抗性肽的MIC值
[0055]
[0056]實施例6:突變菌株脂多糖(LPS)毒性分析 [0057] 1、突變菌株LPS的提取及純化
[0058] LPS的提取采用熱酚法。將過夜培養的菌液按初始0D6QQ = 0.02轉接到800mL LB液 體培養基中，37°C培養12小時后8000rpm離心10min收集菌體，ddH20洗滌菌體一次后稱量菌 體濕重，每3g濕菌體溶于10mL ddH20中，68 °C預熱。加入等體積預熱的90 %苯酚，68°C劇烈 振蕩1小時。低溫冷卻后，4°C，4000rpm離心20分鐘，上清液用ddH20透析三天以去除苯酚，真 空冷凍干燥得到LPS粗品。粗品用適量ddH 20重懸后，加入RNaseA(終濃度50μg/ml)和DNase I (終濃度l〇〇μg/ml) 37 °C處理2小時，再加入蛋白酶K (終濃度100μg/ml) 37 °C處理過夜。酶處 理后的樣品中加入5mL水飽和苯酸，混勾，4000rpm離心30分鐘，上清液用ddH2〇透析一天，真 空冷凍干燥得到LPS。將LPS復溶到氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v)，渦旋振蕩30秒，12000rpm離心 10分鐘，移除上清，沉淀復溶在水中，真空冷凍干燥得到LPS純品。
[0059] 2、LPS刺激小鼠巨噬細胞白血病細胞RAW264.7后產生TNF-α的分析
[0060] RAW264.7接種于96孔板，每孔105個細胞，37°C，5%C02培養12小時后，細胞貼壁，換 新鮮培養液，加入不同濃度LPS(終濃度分別為1、10、100、1000ng/ml)，刺激24小時后取上清 液，使用ELISA試劑盒(Duoset)檢測TNF-a含量（圖6KRAW264.7細胞產生的TNF-a含量隨著 LPS刺激濃度的增加而增加。
[0061 ] 有圖6可知，PH5.0BAA894產生的最少，因為低pH條件下類脂A上發生磷酸乙醇胺的 修飾，中和了表面負電荷，不容易被細胞識別。敲除ESA-02008基因的基因工程菌（即BAA894 AeptA)的類脂A，類脂A上的修飾完全缺失，在LPS濃度為10ng/ml-1000ng/ml時產生細胞因 子TNF-a比野生型菌生產的類脂A增加1.6倍。
[0062]因此，該基因的激活，可應用于后續疫苗佐劑的開發。
[0063]實施例7:Cac〇-2細胞的侵染實驗
[0064] Caco-2細胞使用MEM培養基+10%胎牛血清(含100U/mL青霉素，100yL/mL鏈霉素， 4500mg/L葡萄糖，2mmol/L L-谷氨酰胺），37 °C，5 % C〇2培養箱培養，800r/min離心5min收集 細胞，并用緩沖液洗去胰酶;細胞計數后重懸在無抗的細胞培養基中，向24孔組織培養 板各個孔中加入500yL細胞(約1 X 105個細胞）；在37 °C，5 % C02培養箱中過夜培養;過夜培養 的菌液按1 %的接種量轉接，37°C，200r/min培養3h;取lmL菌液，5000r/min離心5min收集菌 體;將菌體重懸至TOS緩沖液，并測定0D 6QQ值；用無抗的細胞培養基將菌液稀釋至菌體濃度 大約為107cfu/500yL;倒掉過夜培養細胞的培養基，添加菌液500yL至24孔組織培養板中， 37°C，5%C0 2培養箱中靜置培養3h，棄掉之前的培養基，加入含有100μg/ml慶大霉素的新鮮 培養基，培養lh。用roS清洗細胞兩次，然后加200yL0.25 %含EDTA的胰酶消化細胞2min，加 入300yL的0.5 %Tri ton X-100裂解細胞;將細胞裂解液稀釋至合適的濃度，涂平板37 °C培 養過夜并統計菌落數，每個樣品三個平行。
[0065] Caco-2細胞是一種人克隆結腸腺癌細胞，結構和功能類似于分化的小腸上皮細 胞，是被廣泛應用于腸道吸收的細胞模型。2002年被FDA批準認定為動物實驗代替方法。 C.sakazakii屬于腸道菌，可以穿透血腦屏障引起腦膜炎等疾病。實驗結果如圖7所示，結果 顯示ESA-02008突變株的入侵Caco-2細胞的能力減弱，其毒性減弱。
[0066]實施例8: C.sakazakii突變菌株的在巨噬細胞內的存活能力。
[0067] C.sakazakii是一種食源性致病菌，具有在巨噬細胞中生存繁殖的能力。細菌在巨 噬細胞中的生存，與其自身毒性有必要的關聯。細菌毒性越小在巨噬細胞中繁殖能力越弱； 當細菌表現出強度性時，細菌自身在巨噬細胞中的生存和繁殖能力也會有所提高。本發明 測定了不同pH條件下C. sakazakii BAA_894、C. sakazakiiBAA-894 Δ ESA-02008突變菌株在 單核巨噬細胞THP-1細胞中的生存能力，從而反應該基因對于細菌自身毒性的影響。
[0068] 結果顯示（圖8)，C. sakazakii BAA-894野生型和回補株在巨噬細胞中繁殖速率較 快，C. sakazakiiBAA-894 AESA-02008(即BAA894AeptA)突變菌株均比其相應野生型菌株 在巨噬細胞中的繁殖水平有明顯的降低。在24h和48h時間段，細菌繁殖速度最快，72h開始 降低，96h更低。可見，C. sakazakii BAA894在巨噬細胞內存活多于96h，而且ESA-02008基因 缺失，使得該菌的類脂A結構上沒有了磷酸乙醇胺的修飾，更容易被細胞殺死，該基因與菌 株的毒力有一定的作用。
[0069]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種Cronobacter sakazakii的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌缺失了 ESA-02008基因片段。2. 根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述ESA-02008基因片段的核苷酸 序列是SEQ ID N0:1的序列。3. 根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌為無抗性 C.sakazakii BAA894AESA_02008,以Cronobacter sakazakii BAA894為出發菌、缺失了核 苷酸序列為SEQ ID NO: 1的ESA-02008基因片段。4. 根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的構建方法如下： 將人工構建的ESA-02008敲除片段電轉含pKD46質粒的C. sakazakii BAA894,獲得突變株 C. sakazakii BAA894 Δ ESA-02008-loxPkan，再化轉入pKD-Cre質粒，通過位點特異性重組 敲除卡那霉素抗性基因；去除pKD-Cre質粒后獲得無抗性lipid A的基因結構突變的基因工 程菌。5. 根據權利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述ESA-02008敲除片段的核苷酸 序列如SEQ ID NO:2所示。6. 一種降低Cronobacter sakazakii對陽離子抗菌肽抗性和/或降低Cronobacter sakazakii細胞毒性和/或降低Cronobacter sakazakii菌株在巨細胞中的繁殖水平和/ 或提高細胞因子產量的方法，其特征在于，所述方法是敲除Cronobacter sakazakii菌的 ESA-02008基因片段。7. 權利要求1-5任一所述基因工程菌在制備類脂A方面的應用。8. 權利要求1-5任一所述基因工程菌在制備疫苗或疫苗佐劑方面的應用。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述應用是對基因工程菌的類脂A進行提 取，然后利用類脂A制備疫苗或疫苗佐劑。
【專利摘要】本發明公開了一種Cronobactersakazakii的類脂A突變株的構建及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明通過將Cronobacter？sakazakii菌株的ESA-02008基因片段進行敲除，使Cronobacter？sakazakii菌株對陽離子抗菌肽抗性降低了32倍、Cronobacter？sakazakii細胞毒性降低了27％、Cronobacter？sakazakii菌株在巨噬細胞中的繁殖水平顯著降低，同時還得到了發生結構突變的類脂A。本發明的結構突變的類脂A的修飾完全缺失。
【IPC分類】C12N15/74, C12N1/21, C12P7/64, C12R1/01
【公開號】CN105647843
【申請號】
【發明人】李顏顏, 王小元, 劉璐, 云建, 賈向印
【申請人】江南大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月29日