；用PBS清洗 細胞兩次，然后加200yL0.25 %含EDTA的胰酶消化細胞2min，加入300yL的0.5 %Triton X-100裂解細胞;將細胞裂解液稀釋至合適的濃度，涂平板37 °C培養過夜并統計菌落數，每個 樣品三個平行。
[0031 ]實施例 1:突變株 C · sakazaki iBAA894AESA-02008 的構建
[0032] 1、ESA-02008和ESA-03574基因敲除片段的獲得
[0033]采用化學全合成或PCR分步擴增的方法獲得ESA-02008基因敲除片段，其兩端分別 為ESA-02008基因上下游同源臂、中間為帶有LoxP位點的kan片段。ESA-02008基因敲除片段 的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。將ESA-02008基因敲除片段克隆到pBlueScriptIISK ( + )，獲得重組質粒pBlueScript II SK( + )-ESA-02008U-Lkan-ESA-02008D。以該質粒為模 板，可以擴增獲得敲除片段ESA-02008U-Lkan-ESA-02008D。
[0034] 2、敲除感受態的制備及電轉化
[0035] 接種帶有Red重組輔助質粒pKD46(Datsenko K A,Wanner B L.One-Step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products.ProcNatlAcadSci U S A,2000,97(12):6640-6645)的Cronobacter sakazakii BAA894于含100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，30 °C，200rpm過夜培養。按2 %接種量 轉接100mL LB液體培養基，30°C，200rpm培養至0D6Q() = 0.2時加入L-阿拉伯糖（終濃度為 30mmo 1 /L)誘導重組酶的表達，繼續培養0D6QQ = 0.5，將培養液冰浴半小時后轉入預冷的 50mL離心管中，4°C、4000rpm離心10min收集菌體，沉淀用預冷的10%甘油洗滌3次，最后用 lmL 10%甘油懸浮，每管80μL分裝至預冷的無菌EP管中。
[0036] 將500-1000ng ESA-02008敲除片段加入感受態細胞中，混勻，冰浴15min，1.5kv電 擊5ms，30 °C孵育2h，涂布30yg/mL卡那霉素的LB固體平板，30 °C培養，挑取轉化子于含30yg/ mL卡那霉素及100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，PCR驗證結果。
[0037] 3、突變株抗性標記的去除
[0038]將PCR驗證陽性的菌株接種含30yg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，42°C過夜培 養，將培養液劃線SOyg/mL卡那霉素的LB固體平板，37 °C培養，挑取單菌落驗證其對氨芐青 霉素的敏感性，將含有卡那霉素抗性并對氨芐青霉素敏感的菌株命名為 C. sakazaki iBAA894AESA_02008: : kan并保藏。以此為出發菌株做感受態，轉入pKD-Cre質 粒，42 °C熱激表達FLP酶，將陽性菌株于含100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，加 入L-阿拉伯糖(終濃度為30mmol/L)誘導Cre重組酶的表達，介導LoxP位點特異性重組，PCR 驗證挑選轉化子。將PCR驗證正確的菌株42 °C熱激后劃線LB平板，挑取單菌落驗證其對氨芐 青霉素及卡那霉素的敏感性，選取對兩種抗生素均敏感的菌株命名為C.sakazakiiBAA894 AESA-02008并保藏。
[0039] 實施例2:野生型BAA894中ESA-02008基因在低pH條件下的轉錄
[0040]總RNA提取：利用Simply P Total RNA Extrection Kit(購自Bioflux公司）分別 提取BAA894在pH 7.0和pH 5.0條件下的總RNA。以去除DNA污染的RNA為模板，利用 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(購自Thermo Scientific)合成cDNA。以 16SrRNA作為內參，每組三個平行，檢測ESA-02008基因在低pH下的轉錄水平。結果如圖1所 示，從圖1能夠看出pH 5.0條件下BAA894中ESA-02008基因的相對表達量是pH7.0條件下的8 倍，即ESA-02008基因在低pH條件下的表達量增加，說明該基因受低pH調控。
[0041 ] 實施例3:野生型C.sakazakii BAA894在pH 7.0和pH 5.0條件下的類脂A結構分析
[0042] 1、野生型C.sakazakiiBAA894類脂A結構在pH 7.0和pH 5.0條件下的提取及薄層 層析(TLC)分析。
[0043] lipid A的提取方法采用氯仿/甲醇/H20溶液混合相萃取法。將過夜培養的菌液按 初始OD600 = 0.02轉接到400mL LB液體培養基中，37°C培養至菌體對數期后期時，4000rpm離 心30min收集菌體，ddH2〇洗滌菌體一次后用Bligh-Dyer-相體系(氯仿/甲醇/水溶液，1: 2: 0.8，v/v/v)90mL懸浮菌體，磁力攪拌lh，2000rpm離心30min分相，使用一相體系洗滌細胞碎 片2-3次;加入27mL 12.5mM的醋酸鈉(PH4.5)溶液，超聲震蕩2min，100°C水浴30min裂解糖 鏈。冷至室溫后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成B1 igh-Dyer二相體系（氯仿/甲醇/水，2 : 2: 1.8，v/v/v)，2000rpm離心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋轉蒸發。加入氯仿/甲醇溶液(4: l，v/v)將lipidA洗出。接著進行薄層層析(TLC)檢測，將樣品點于Gel 60TLC板上，展層劑為 氯仿/甲醇/水/氨水(25:15:4:2，v/ v/v/v)。層析結束后吹干板上殘留的展層劑，用溶于乙 醇的10%硫酸進行碳化，置于加熱板上顯色(結果如圖2)。
[0044] TLC結果顯示該方法提取C.sakazakiiBAA894類脂A在pH 5.0條件下比pH 7.0多了 個點，說明在低pH下發生了修飾。
[0045] 2、類脂A結構的ESI/MS分析
[0046] 類脂樣品溶于氯仿/甲醇溶液（4:l，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-T0F Mass Spectrometer質譜儀上進行質譜檢測。采用ESI離子源，陰離子檢測模式，檢測范圍小于m/z 2500 C3BAA894在pH 7.0條件下的類脂A主峰值1796.3和1825.3; 1716.3和1745.3為掉一個磷 酸基團的峰值。而在pH 5.0條件下，峰值多了 1840.3、1868.3、1919.3、1948.3，分別于對應 的pH 7.0的類脂A峰值上多了 123Da，即一個磷酸乙醇胺，ESA-02008基因（結果如圖3)。
[0047] 實施例4:突變菌株C.sakazakii AESA-02008的類脂A結構ESI/MS分析
[0048]類脂A的提取方法采用氯仿/甲醇/H20溶液混合相萃取法。將過夜培養的菌液按初 始0D6QQ = 0.02轉接到200mL LB液體培養基中，37°C培養至菌體對數期后期時，4000rpm離心 30min收集菌體，ddH2〇洗滌菌體一次后用B1 igh-Dyer-相體系（氯仿/甲醇/水溶液，1: 2: 0.8，v/v/v) 76mL懸浮菌體，磁力攪拌lh，2000rpm離心30min分相，使用一相體系洗滌細胞碎 片2-3次;加入27mL 12.5mM的醋酸鈉 (pH 4.5)溶液，超聲震蕩2min，100°C水浴30min裂解糖 鏈。冷至室溫后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成B1 igh-Dyer二相體系（氯仿/甲醇/水，2 : 2: 1.8，v/v/v)，2000rpm離心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋轉蒸發。加入氯仿/甲醇溶液(4: 1，v/v)將1 ipidA洗出。類脂樣品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-T0F Mass Spectrometer質譜儀上進行質譜檢測。采用ESI離子源，陰離子檢測模式，檢測范圍小 于m/z 2500。結果如圖4所示，結果說明敲除ESA-02008基因的基因工程菌的類脂A，類脂A上 的修飾完全缺失。
[0049] 實施例5:突變株對陽離子抗性肽的抗性。
[0050] 采用微量肉湯稀釋法分別測定C.sakazakiiBAA894野生型和突變株對粘菌素的 MIC值。
[0051] 粘菌素是由多粘芽孢桿菌產生的一組多肽類抗生素。其環形多肽部分的氨基與細 菌外膜脂多糖的2價陽離子結合點產生靜電相互作用，使外膜的完整性破壞，導致胞漿內的 磷酸、核苷等小分子外溢，引起細胞功能障礙直至死亡。
[0052] 抗生素用LB液體培養基倍比稀釋，使polymyxin B濃度分別為50、25、12.5、6.25、 3.125、1.56、0.78、0.39、0.1948/11^而。〇118^11濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625、 7.8125、3.90625、1.8、0.9、0.45yg/mL加入96孔板中，留一排新型LB培養基作生長對照；另 將等體積0D 6Q() = 0.01的稀釋菌液加入96孔板中，蓋上蓋子，37°C靜置