上述結果，與control組相比，ASP 50 μg/ml可促進BMSCs細胞增殖(P〈0.01);故 選ASP最佳藥物濃度為50μg/ml。
[0047] ASP對腫瘤相關炎性微環境中BMSCs形態學的影響 為了探討ASP對腫瘤相關炎性微環境中BMSCs生物學特性的影響，我們采用炎性因子誘 導BMSCs 46d，同時給予ASP干預，并在培養46d后置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態，發現正 常BMSCs組細胞為長梭形，成纖維細胞樣，形態均一，排列整齊，呈現旋渦狀生長;TGF-βΙ組 細胞未見明顯改變；IL-6組BMSCs細胞部分排列紊亂、成團簇狀生長、呈現一定的異型性； IL-6+ TGF-βΙ組細胞排列紊亂更明顯；IL-6+ASP組細胞為成纖維樣，排列較整齊；IL-6+ TGF-f31+ASP組細胞為成纖維樣，排列分布較均勻，具體參見圖2。其中，A: BMSCs組;B: TGF-βΙ 組；C: IL-6組；D: IL-6+ TGF-m組；E: IL-6+ASP組；F: IL-6+TGF-m+ASP組。
[0048] 4.3 ASP對腫瘤相關炎性微環境中BMSCs細胞骨架的影響 微絲作為細胞骨架的重要組成部分，在不同種類的細胞中結構存在差異。微絲為細胞 整體結構的一種局部表現，參與細胞形態的維持。除此之外，微絲也可通過一些途徑調控細 胞信號的傳遞進一步影響細胞的功能，如細胞的增殖、凋亡、分化、惡性腫瘤的形成及轉移 等。微絲結構的改變與細胞的功能變化有一定的關聯性。微絲結構的調整與腫瘤的轉移有 密切的關系。微絲結構的調整伴有細胞外基質的降解，從而影響腫瘤的向鄰近或遠處的轉 移。研究發現，TRI0BP-4/-5能增強胰腺癌細胞的運動能力和引起微絲的重組。Yin等研究發 現，中性粒細胞和激活的單核細胞分泌的S100A8/A9與其受體RAGE結合通過肌動蛋白聚合、 增強細胞的間質特性和EMT促進人乳腺癌細胞的侵襲、迀移，其中的機制是通過NF-κΒ信號 通路穩定Snail實現的；在低濃度下，S100A8/A9具有增強細胞增殖能力的作用;RAGE的表達 與浸潤性導管癌患者的淋巴結和遠處轉移密切相關。有研究表明，正常細胞的惡性轉化伴 隨著細胞骨架發生異常改變，細胞骨架已成為反映腫瘤細胞的惡性的生物學行為的特征之 〇
[0049] 實驗結果如圖3所示，正常BMSCs組細胞微絲平行排列；TGF-βΙ組細胞微絲未見明 顯改變；IL-6組BMSCs細胞部分微絲排列紊亂；IL-6+ TGF-βΙ組細胞微絲排列紊亂；IL-6+ ASP組細胞微絲排列整齊，偶見散亂分布，IL-6+TGF-m+ASP組細胞微絲平行排列，部分散亂 分布。圖3中，A:BMSCs組;B: TGF-βΙ組；C: IL-6組;D: IL-6+ TGF-βΙ組;E: IL-6+ASP組;F: IL-6+TGF-m+ASP 組。
[0050] ASP對腫瘤相關炎性微環境中BMSCs增殖能力的影響 為了比較ASP對腫瘤相關炎性微環境中BMSCs增殖的影響，我們用CCK-8法定量分析ASP 對炎性微環境中BMSCs增殖情況，并繪制了增殖曲線。發現，與正常BMSCs組比較，IL-6組在 第4~7天，細胞生長速度顯著增快，差異有統計學意義(P<0.05);與正常BMSCs組比較，IL-6 +TGF-f31組細胞生長速度增快更顯著；與IL-6或TGF-βΙ單獨組比較，第6、7天IL-6+TGF-m聯 合組，細胞生長速度顯著增快，差異有統計學意義(P<〇. 05);與IL-6組比較，ASP+IL-6組 在第4~7天，細胞生長速度緩慢，差異有統計學意義(P<0.05);與IL-6+TGF-m組比較，IL-6 +TGF-f31+ASP組細胞生長速度明顯減慢（表2和圖4)。
[0051 ] 表2炎性因子誘導后各組細胞吸光度值（土s，n=4)
*P<0 · 05，與 BMSCs 組比較;ΛΡ<0 · 05，與 IL-6 組比較;VP<0 · 05，與 IL-6+TGF-m 組比 較。
[0052] ASP對腫瘤相關炎性微環境中BMSCs增殖基因 Bcl-2、癌基因 Ras蛋白表達的影響 信號車專導和車專錄激活因子_3(Signal transducer and activator of transcription 3, STAT3 )是STAT家族的重要組成成員，已成為近年腫瘤研究的重要調控分子。STAT3信號 通路是由胞外傳遞到胞內的一條重要信號通路，STAT3在細胞外被磷酸化后形成P-STAT后， 進入細胞核進而調控基因的表達，參與調控腫瘤的形成、侵襲和轉移等。在正常生理狀態 下，STAT3的激活是快速而短暫的，對于正常細胞的生理功能起著關鍵性作用。STAT3是 EGFR、IL-6/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道的匯聚焦點，在多種腫瘤細胞中均 發現有持續性過度激活。臨床研究發現，在某些腫瘤中，STAT3活性發生異常活化，且其活化 水平與患者的不良預后呈正相關，如肝癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、胃癌、前列腺癌等。STAT3 過度激活后誘導與細胞增殖、分化、凋亡密切相關的關鍵基因異常高表達，通過各種途徑促 進細胞增殖和惡性轉化、阻礙細胞凋亡，表現出致癌作用。Sui等報道阻斷STAT3的活化能抑 制肝癌細胞的生長和延長荷瘤小鼠的存活時間；STAT3信號通路的阻斷能夠放大NK細胞的 細胞毒效應，升高NK細胞活化分子的表達，降低IL-10和TGF-β的表達進而起到抑制肝癌細 胞生長的作用。Zhao等研究發現在使用MEK抑制劑一靶向Ras通路后，STAT在腫瘤細胞中異 常活化;聯合使用STAT3抑制劑可抑制胰腺癌和結腸癌的生長，揭示STAT3活化可能是腫瘤 細胞抵抗MEK抑制劑的一個可能機制。
[0053] STAT3異常激活可影響其下游抑癌基因 p53與原癌基因 Ras、促凋亡基因 Bax與抗凋 亡基因 Bcl-2的表達。增殖與凋亡的失衡是腫瘤形成的一個重要過程。此外癌基因的活化與 抑癌基因的缺失也是細胞發生惡性表型轉化的一個重要原因。抑癌基因 P53具有維持細胞 正常生長、抑制細胞惡性增殖中起著非常重要的作用。眾所周知，P53通過破壞細胞線粒體 的完整性，釋放下游的細胞因子，并最終激活半胱天冬酶而誘導細胞凋亡。Ras基因家族包 括K-ra S、H-raS等，在正常細胞中原癌基因 Ras能促進細胞増殖和生長，當其受到不良因素 的影響發生突變激活時，能持續促進細胞異常增殖，進而使細胞發生惡性轉化。但是研究發 現單獨激活癌基因 Ras不會使細胞發生惡性轉化，它需要在某些抑癌基因失活或其它的條 件共同作用下才能使細胞發生惡性轉化。研究報道在胰腺癌和結腸癌腫瘤中存在K-ras的 突變，并且與靶向Ras通路的MEK抑制的抵抗有密切關系。RAS蛋白的激活通過內部的GTP酶 的活力促進腫瘤形成，包括基因表達、細胞周期進展、細胞增殖、細胞迀移等一系列細胞活 動。
[0054] Bcl-2家族蛋白是一個通過線粒體途徑的調節而誘導細胞凋亡的蛋白質家族。它 包括促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2。這些蛋白通過共同調節線粒體膜通透性，促進釋 放促凋亡相關蛋白，從而導致細胞凋亡。
[0055]為了比較ASP對腫瘤相關炎性微環境中BMSCs蛋白表達的影響，我們用Western b 1 〇t法檢測了各組Be 1 -2、Ras蛋白的表達。結果顯示，與正常對照BMSCs組比較，TGF-βΙ組 Ras、Bcl-2蛋白表達均有升高；IL-6組Ras、Bcl-2蛋白表達均有升高，差異有統計學意義(P〈 0.05) ; IL-6+TGF-m組Ras、Bcl-2蛋白表達均明顯升高，差異有統計學意義。與IL-6組比較， IL-6+ASP組Ras、Bcl-2、蛋白表達均下調，差異有統計學意義；與IL-6+TGF-m組比較，IL-6+ TGF-f31+ASP組Ras、Bcl-2蛋白表達均下調，差異有統計學意義。具體結果參見圖5,其中，A: BMSCs組；B: TGF-βΙ組；C: IL-6組；D: IL-6+ TGF-βΙ組；E: IL-6+ASP組；F: IL-6+TGF-m+ ASP 組。
[0056] 5 結論 5.1炎性微環境能誘導正常BMSCs細胞發生遺傳穩定性改變 以上實驗結果顯示在炎性微環境中已改變了正常BMSCs的形態、微絲及增殖能力，提示 該炎性微環境能誘導正常BMSCs細胞發生遺傳穩定性改變，而這與文獻報道相符合。
[0057] ASP對炎性微環境中BMSCs具有保護作用 中醫的先天之精與西醫的干細胞在生理功能方面存在很多相似相通之處，先天之精在 細胞層面上的存在形式是干細胞。干細胞對機體的生長、發育、更新及損傷修復起著十分重 要的作用，調節著機體的生長發育過程以及疾病的發展，其分布十分廣泛。干細胞是稟受于 父母的先天之精的物質基礎。臟腑之精藏于腎，是由來自父母先天之精和來自水谷精微的 后天之精相結合產生的;干細胞更新以及所分化形成的不同階段的子代細胞以維持機體的 平衡狀態是人體之精的生理功能的表現;在損傷因素的刺激下，成體干細胞通過各種過程 修復損傷是由先天之精和后天之精構成的臟