中BMSCs細胞生物學特性出現遺傳穩定性變化，該變化可能 與炎性微環境可促使BMSCs中STAT3信號通路激活有一定相關性;ASP可抑制BMSCs在炎性微 環境中的遺傳穩定性的變化，其分子機制可能與ASP改善炎性微環境的失衡狀態，調控增殖 基因 Bcl-2、癌基因 Ras蛋白表達的變化有關。
【附圖說明】
[0023]附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實 施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中： 圖1為不同濃度ASP對BMSCs增殖影響； 圖2為炎性因子誘導后各組細胞形態變化(46 day，10 X 10); 圖3為炎性因子誘導后各組細胞微絲變化(46 day，10 X 10); 圖4為炎性因子誘導后各組細胞增殖曲線(46 day); 圖5為炎性因子誘導后各組細胞蛋白表達變化。
【具體實施方式】
[0024]以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。
[0025] 實施例1 1當歸多糖(ASP)的制備 (1)當歸的預處理 將當歸藥材粉碎為最粗粉，加90-95%乙醇提取兩次，每次0.5-1.5 h，加液量分別為6倍 和4倍，將脫脂后的當歸藥渣于空氣中晾干，揮發去溶劑后收集待用。
[0026] (2)多糖的提取 取醇提后的當歸藥渣用水煎法提取3次，每次0.5-1.5h，加水量分別為8、6、6倍，過濾， 合并濾液。
[0027] (3)多糖的純化 將上述濾液減壓濃縮后采用反復凍融法除蛋白質，將除去蛋白質的提取液濃縮至密度 為1.2,加95%乙醇至醇體積濃度為75-80%，低溫靜置22-26h后離心，取沉淀復溶后按上述方 法第二次醇沉，沉淀用無水乙醇反復清洗，70°C減壓干燥，即得多糖干膏粉，稱量。提取率為 4.6%〇
[0028]使用時，將多糖干膏粉溶于蒸餾水中，得到當歸多糖藥液。
[0029] (4)多糖含量測定 以葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法測定干膏粉中多糖含量，純度為72%。
[0030] (5)藥物濃度篩選 小鼠 BMSCs細胞株(購自廣州賽業生物科技有限公司，編號:MUBMX-01001)，細胞貼壁 后，加入ASP進行藥物濃度篩選： a、 藥物ASP組:依次加入濃度為12.5、50、100、200μg/ml的當歸多糖藥液100μΙ; b、 對照組:加入等體積的DMEM/F12完全培養基。
[0031] 每組設3個實驗孔，3個復孔;不接種細胞的空白組為調零孔。原條件下繼續培養 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h〇
[0032] 用CCK-8法檢測對細胞增殖率的影響，具體方法如下： 于各時間點終止培養后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育培養箱中繼續培養4 h。終止 培養后直接在450 nm波長處檢測各組細胞的吸光度0D值。重復三次實驗，并按公式計算增 殖率。
[0033] 細胞增殖率=(藥物組0D值-調零組0D值)/(對照組0D值-調零組0D值）X100%。 [0034]實驗方法 2.1炎性微環境的建立 取第2代的狀態良好的BMSCs細胞，使用MSCM培養基（間充質干細胞基礎培養基(MSCM) 購自美國ScienCell公司）調整成細胞濃度為1 X 104個/mL的單細胞懸液，每孔2mL接種于六 孔板內，采用50 ng/mL IL-6、2 ng/mL TGF-βΙ進行單獨誘導和聯合誘導7d，每天觀察細胞。 [0035] 分組如下： BMSCs組：以六孔板單獨培養的BMSCs細胞作為對照組； IL-6組：以50 ng/mL IL-6單獨干預BMSCs細胞作為模型組1; TGF-βΙ組：以2 ng/mL TGF-βΙ單獨干預BMSCs細胞作為模型組2; IL-6+TGF-m組：以50 ng/mL IL-6和2 ng/mL TGF-βΙ聯合干預BMSCs細胞作為模型組 3； ASP+IL-6組：以50 yg/mL ASP干預IL-6組作為實驗組1; ASP+ IL-6+TGF-m組：以50 yg/mL ASP干預IL-6+TGF-m組作為實驗組2。
[0036] 各組分別連續誘導7d，每72 h換液一次，同時添加 IL-6、TGF-m和ASP以維持其最 佳濃度。7d之后，將細胞進行傳代，連續培養。采用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態直至 形態發生變化，之后進行相關指標的檢測。
[0037]細胞形態學觀察 倒置相差顯微鏡下，觀察各組細胞的形態，采集圖像。
[0038]細胞骨架染色 1. 將誘導后的各組細胞分別接種于激光共聚焦培養皿，5%⑶2、飽和濕度、37°C孵箱 中培養，待細胞長至50%~60%，終止培養； 2. 棄培養液，PBS洗滌細胞2次； 3. 用新鮮配制的4%多聚甲醛固定15min，用含0. l%Triton-X 100的PBS緩沖液洗3次， 每次5min; 4. 用含有5%BSA和0. l%Triton-X 100的PBS緩沖液按照說明書稀釋比例稀釋Actin-Tracker Green，即為Actin-Tracker Green工作液，加到細胞上，室溫避光孵育lh; 5. 用含0.1%Triton-X 100的roS緩沖液洗3次，每次5min; 6. 加入DAPI染液，避光孵育30min。用含0.1%Triton-X 100 PBS洗3次，每次5min; 7. 加入抗熒光淬滅劑，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞并采集圖像。
[0039]法檢測細胞增殖能力并繪制各組細胞生長曲線 誘導培養46d(即第7代)后終止，轉移細胞至培養瓶中培養。收集處于對數期的各組細 胞，0.25%胰蛋白酶消化，倒置相差顯微鏡下觀察，待細胞間隙增大，折光性增強，成為單個 細胞時，用MSCM培養基將其吹散成單細胞懸液，計數、調整細胞密度為IX 104個/mL，每孔 200 yL接種于96孔培養板中，5%C02、37°C飽和濕度孵箱中繼續培養，每72h換液一次。
[0040] 接種后第1、2、3、4、5、6、7天分別采用CCK-8法檢測各組細胞吸光值。每孔加入10 μ L CCK-8溶液，繼續孵育4 h。終止培養，用酶標儀讀取450 nm波長處的各組吸光度0D值。重 復3次實驗，取平均值，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制細胞增殖曲線圖。
[0041 ] Western blot技術檢測蛋白的表達 2.5.1總蛋白的提取和制備 2.5.1.1細胞總蛋白的提取 終止各組細胞培養，用預冷的PBS緩沖液沖洗2次;加入1 mLPBS緩沖液，用細胞刮刀沿 瓶壁同一方向刮取細胞，并沖洗瓶壁;轉移液體至提前做好標記的1.5 mL離心管內，12000 rpm、4°C離心8 min，去除上清；向離心管中加入200 yL含有蛋白酶抑制劑（PMSF，購自 Appl iChem公司）的RIPA裂解液，吹打使其重懸;超聲波細胞破碎儀上將細胞破碎4 s，間歇2 s，反復4次；12000 rpm、4°C離心8 min吸取上清，上清即為細胞總蛋白。以上操作均在冰上 進行。
[0042] 2.5.1.2蛋白濃度測定 按照BCA定量試劑盒說明書進行操作：多標記分析儀562 nm波長處測定吸光度0D值。 繪制標準曲線，并計算相應蛋白濃度。
[0043] Western Blot SDS-PAGE電泳、蛋白轉膜、顯色及圖像分析 TBST洗滌經過二抗孵育過的PVDF膜3次，每次8 min;顯影定影試劑按照ECL化學發光液 試劑盒中的說明書進行配置，在PVDF膜目的蛋白處均勻滴加 ECL顯影液;保鮮膜封閉后使 用凝膠成像系統采集圖像。后期使用Quantity One軟件計算各條帶的光密度值，以GAPDH 作為內參照，結果將目的蛋白條帶與內參GAPDH條帶的比值作為參照。重復實驗3次。
[0044] 3統計學分析 應用SPSS 21.0統計軟件分析。結果采用均數土標準差（土s)表示，多組間均數的比較 采用one-way AN0VA，兩兩比較采用最小顯著法(LSD)檢驗;兩組間的比較采用Student's test，p〈0.05為差異有統計學意義。
[0045] 4實驗結果 4.1當歸多糖濃度的篩選 由表1及圖1可知，50 μg/ml ASP作用24h后，能明顯促進BMSCs增殖(P<0.05)，其中60 h后增殖作用最為明顯(P<0.01)，隨著時間延長，增殖作用較前減弱。100 μg/ml和200 yg/ ml APS對BMSCs生長有抑制作用。其中100 μg/ml在作用60 h后對BMSCs增殖有明顯抑制作 用(P<0.01);200 μg/ml APS作用BMSCsl2 h后，其抑制作用明顯(P<0.01)，且具有時間依 賴性。
[0046] 表1不同濃度ASP對BMSCs增殖的影響
*表示與control組比較P〈0 · 05 表示與control組比較P〈0 · 01 · 結合