] 有益效果： 1、目前國內外已開展了多項干細胞(指非造血干細胞)臨床應用研究，涉及多種干細胞 類型及多種疾病類型。主要疾病類型包括骨關節疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反應 (GVHD)、脊髓損傷及退行性神經系統疾病、眼表疾病和糖尿病等。臍帶組織來源的間充質干 細胞，具有一定的多向分化潛能及抗炎和免疫調控能力等，并且來源廣泛，屬于醫療廢棄物 易獲取。但是其在用于一些疾病如眼表疾病、關節修復和子宮內膜修復時，使用目前的治療 途徑效果欠佳，限制了其應用。羊膜可減輕炎癥程度、縮短炎癥持續時間、抑制新生血管形 成和抑制纖維化、減輕瘢痕形成的功能。臨床上羊膜單獨使用應用于眼表、關節和子宮內膜 表面已經獲得了一些可喜的臨床效果，但是由于缺乏種子細胞對于組織損傷嚴重的病人效 果有限。本發明將hUC-MSCs接種于羊膜上，使其固定再進行特定部位的損傷修復，彌補了單 獨使用hUC-MSCs或者羊膜治療的不足，使其功效更加顯著。
[0018] 2、本發明將hUC-MSCs和人源羊膜結合起來，取長補短，為一些難治性疾病提供了 新的治療策略，也為干細胞的臨床應用開辟了新的治療途徑。
[0019] 3、本發明使用本單位發明專利"羊膜載體套環"，增加了技術的可操作性，制成移 植片后臨床使用方便，為干細胞臨床應用這一新的治療途徑增加了可行性。
【具體實施方式】
[0020] 以下結合【具體實施方式】對本發明作進一步的說明： 實施例1 一種使用hUC-MSCs和羊膜構建細胞移植片的方法，它包括如下步驟： (1) 取新鮮采集的人羊膜和臍帶，清洗后臍帶放入生理鹽水中浸泡備用； (2) 羊膜處理:將清洗干凈的羊膜鈍性分離掉絨毛膜，再使用生理鹽水濕潤紗布將羊膜 擦拭干凈，然后將羊膜浸泡入含青霉素150U/ml和硫酸鏈霉素150U/ml的生理鹽水中浸泡 0.5個小時后，放入無菌甘油中在4°C脫水，脫水時間不超過12小時，再轉入無菌甘油中在-20 °C保存備用； (3) 將浸泡好的臍帶剪成約1~2cm長度的小段，清洗，然后將臍帶組織轉移至培養皿 中，培養皿中加生理鹽水至淹沒臍帶組織1/2處;將臍帶一端沿靜脈血管平行方向剪口，用 組織鑷沿切口方向靜脈血管邊緣縱向撕開，將1根靜脈血管和2根動脈血管剖離，用組織鑷 去除羊膜，撕取華通氏膠，置于加有生理鹽水的離心管中； (4) 將華通氏膠用生理鹽水充分洗滌，然后剪碎至1~3 mms大小，將剪碎的組織塊均 勻放置到無菌培養皿上，鋪平，沿培養皿邊緣緩慢加入5ml培養液，置于37°C、飽和濕度、體 積分數為5%的C0 3孵箱中培養，每三天更換一次培養液，培養15天后，直至觀察到皿底上 形成多個大小不一、細胞數量密集的細胞島時，則獲得原代hUC-MSCs; (5) 將培養液完全移出，向原代培養皿中加入質量百分比為0.05 %的胰酶lml，放入37 °C培養箱中消化，當觀察到貼壁細胞圓縮，且已經脫離瓶底后，加入5ml培養液終止消化，將 懸液移至離心管中，離心棄上清，離心管中加入新培養液，反復吹打至其分散為單個細胞懸 液，再把細胞懸液調節成4000個細胞/cm 2體系接種于培養瓶中置于37°C、飽和濕度、體積分 數為5 %的CO 2孵箱中繼續培養，每3-4天換培養液一次，至融合度達80-90 %，即得hUC-MSCs，將細胞收獲后凍存備用； (6) 取步驟(2)中凍存的羊膜，放入無菌生理鹽水中水化10分鐘，將水化好的的羊膜移 至無囷培養皿中備用； (7) 將步驟(6)制備的羊膜平鋪于羊膜載體套環上，然后移入無菌培養皿中，放入37°C C〇:i孵箱中待用； (8) 將凍存的hUC-MSCs復蘇，將細胞密度調節至4000個細胞/cm2體系接種于用步驟(7) 的培養皿中，置于37°C、飽和濕度、體積分數為5%的C0: 3孵箱中培養，3-5天后，細胞融合度 達80-90 %即得細胞移植片。
[0021] 本實施例的流式表型檢測包括以下步驟： ①取四根流式管，分別標記為分離傳代細胞樣本管1和分離傳代細胞樣本管2;細胞移 植片上消化下來細胞樣本管3和細胞移植片上消化下來細胞樣本管4。
[0022] ②分別將相同量的步驟(5)中分離傳代細胞和步驟(8)細胞移植片上消化下來的 細胞(有核細胞數2_5*105個)加入到相對應標記的各流式管中，不可粘到管壁。
[0023] ③分離傳代細胞樣本管1加入CD34-FITC、CD29-PE、CD45-percp、CD44-APC;分離傳 代細胞樣本管2加入CD105-PE、CD45-percp、HLA_DR-APC;細胞移植片上消化下來細胞樣本 管3加入CD34-FITC、CD29-PE、CD45-percp、CD44-APC ;細胞移植片上消化下來細胞樣本管4 加入 CD 105-PE、CD45-per cp、HLA_DR-APC 各 5u 1，混勻。
[0024] ④室溫避光放置15分鐘，加入2mlPBS/管，1400rpm/min，離心5min。
[0025] ⑤棄上清，將管內細胞彈起，加入0.5mlPBS，混勻，上機檢測。
[0026] ⑥上機檢測結果得:CD29、CD44、CD105表達率大于95%，為陽性；CD34、CD45、HLA-DR表達率小于2%，為陰性。
[0027] ⑦上述說明：按照制備方法分離得到的hUC-MSCs與接種于羊膜后的干細胞滿足 CD29、CD44、CD105表達率大于95%，為陽性；CD34、CD45、HLA-DR表達率小于2%，為陰性的 結果，經鑒定為間充質干細胞。
[0028]本實施例的無菌檢測是取步驟(8)細胞移植片培養皿中的培養液作為供試品，取 硫乙醇酸鹽培養基6支、胰酪大豆胨液體培養基4支(每支培養基量均為15毫升）。6支硫乙醇 酸鹽培養基中4支分別接種lml供試品，剩余兩支1支接種不小于lOOcfu金黃色葡萄球菌做 陽性對照，1支做陰性對照。4支胰酪大豆胨培養基中兩支分別接種lml供試品，剩余兩支1支 接種不小于lOOcfu白色念珠菌，1支做陰性對照。接種供試品的4支硫乙醇酸鹽流體培養基 的容器分兩支置于30~35° C培養，兩支置于20~25° C培養，陽性對照和陰性對照置于30~ 35° C培養。胰酪大豆胨培養基4支全部置于20~25° C培養。培養時間為14天。培養期間應逐 日觀察并記錄是否有菌生長。陽性對照在24小時內應有菌生長，樣品管沒有細菌及真菌生 長。(無菌檢測中的硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨培養基均按照《中華人民共和國藥 典》2015版配制）。
[0029] 實施例2 一種使用hUC-MSCs和羊膜構建細胞移植片的方法，它包括如下步驟： (1) 取新鮮采集的人羊膜和臍帶，清洗后臍帶放入生理鹽水中浸泡備用； (2) 羊膜處理:將清洗干凈的羊膜鈍性分離掉絨毛膜，再使用生理鹽水濕潤紗布將羊膜 擦拭干凈，然后將羊膜浸泡入含青霉素200U/ml和硫酸鏈霉素200U/ml的生理鹽水中浸泡1 個小時后，放入無菌甘油中在8°C脫水，脫水時間不超過12小時，再轉入無菌甘油中在-20°C 保存備用； (3) 將浸泡好的臍帶剪成約1~2cm長度的小段，清洗，然后將臍帶組織轉移至培養皿 中，培養皿中加生理鹽水至淹沒臍帶組織1/2處;將臍帶一端沿靜脈血管平行方向剪口，用 組織鑷沿切口方向靜脈血管邊緣縱向撕開，將1根靜脈血管和2根動脈血管剖離，用組織鑷 去除羊膜，撕取華通氏膠，置于加有生理鹽水的離心管中； (4) 將華通氏膠用生理鹽水充分洗滌，然后剪碎至1~3 mms大小，將剪碎的組織塊均 勻放置到無菌培養皿上，鋪平，沿培養皿邊緣緩慢加入l〇ml培養液，置于37 °C、飽和濕度、體 積分數為5%的C03孵箱中培養，每三天更換一次培養液，培養17天后，直至觀察到皿底上 形成多個大小不一、細胞數量密集的細胞島時，則獲得原代hUC-MSCs; (5) 將培養液完全移出，向原代培養皿中加入質量百分比為0.25 %的胰酶3ml，放入37 °C培養箱中消化，當觀察到貼壁細胞圓縮，且已經脫離瓶底后，加入10ml培養液終止消化， 將懸液移至離心管中，離心棄上清，離心管中加入新培養液，反復吹打至其分散為單個細胞 懸液，再把細胞懸液調節成6000個細胞/cm 2體系接種于培養瓶中置于37°C、飽和濕度、