體積 分數為5%的⑶，孵箱中繼續培養，每3-4天換培養液一次，至融合度達80-90 %，即得hUC-MSCs，將細胞收獲后凍存備用； (6) 取步驟(2)中凍存的羊膜，放入無菌生理鹽水中水化30分鐘，將水化好的的羊膜移 至無囷培養皿中備用； (7) 將步驟(6)制備的羊膜平鋪于羊膜載體套環上，然后移入無菌培養皿中，放入37°C C〇:i孵箱中待用； (8) 將凍存的hUC-MSCs復蘇，將細胞密度調節至6000個細胞/cm2體系接種于用步驟(7) 的培養皿中，置于37°C、飽和濕度、體積分數為5%的C0:3孵箱中培養，3-5天后，細胞融合度 達80-90 %即得細胞移植片。
[0030] 本實施例的流式表型檢測步驟與實施例1相同。
[0031] 本實施例的無菌檢測步驟與實施例1相同。
[0032] 實施例3 一種使用hUC-MSCs和羊膜構建細胞移植片的方法，它包括如下步驟： (1) 取新鮮采集的人羊膜和臍帶，清洗后臍帶放入生理鹽水中浸泡備用； (2) 羊膜處理:將清洗干凈的羊膜鈍性分離掉絨毛膜，再使用生理鹽水濕潤紗布將羊膜 擦拭干凈，然后將羊膜浸泡入含青霉素50U/ml和硫酸鏈霉素50U/ml的生理鹽水中浸泡0.5-1個小時后，放入無菌甘油中在2°C脫水，脫水時間不超過12小時，再轉入無菌甘油瓶中在-20 °C保存備用； (3) 將浸泡好的臍帶剪成約1~2cm長度的小段，清洗，然后將臍帶組織轉移至培養皿 中，培養皿中加生理鹽水至淹沒臍帶組織1/2處;將臍帶一端沿靜脈血管平行方向剪口，用 組織鑷沿切口方向靜脈血管邊緣縱向撕開，將1根靜脈血管和2根動脈血管剖離，用組織鑷 去除羊膜，撕取華通氏膠，置于加有生理鹽水的離心管中； (4) 將華通氏膠用生理鹽水充分洗滌，然后剪碎至1~3 mms大小，將剪碎的組織塊均 勻放置到無菌培養皿上，鋪平，沿培養皿邊緣緩慢加入8ml培養液，置于37°C、飽和濕度、體 積分數為5%的C0 ::i孵箱中培養，每三天更換一次培養液，培養20天后，直至觀察到皿底上 形成多個大小不一、細胞數量密集的細胞島時，則獲得hUC-MSCs原代細胞； (5) 將培養液完全移出，向原代培養皿中加入質量百分比為0.25 %的胰酶1~2ml，放入 37°C培養箱中消化，當觀察到貼壁細胞圓縮，且已經脫離瓶底后，加入8ml培養液終止消化， 將懸液移至離心管中，離心棄上清，離心管中加入新培養液，反復吹打至其分散為單個細胞 懸液，再把細胞懸液調節成5000個細胞/cm 2體系接種于培養瓶中置于37°C、飽和濕度、體積 分數為5%的C(b孵箱中繼續培養，每3-4天換培養液一次，至融合度達80-90 %，即得hUC-MSCs，將細胞收獲后凍存備用； (6) 取步驟(2)中凍存的羊膜，放入無菌生理鹽水中水化20分鐘，將水化好的的羊膜移 至無囷培養皿中備用； (7) 將步驟(6)制備的羊膜平鋪于羊膜載體套環上，然后移入無菌培養皿中，放入37°C C0:3孵箱中待用； (8) 將凍存的hUC-MSCs復蘇，將細胞密度調節至5000個細胞/cm2體系接種于用步驟(7) 的培養皿中，置于37°C、飽和濕度、體積分數為5%的Oh孵箱中培養，3-5天后，細胞融合度 達80-90 %即得細胞移植片。
[0033] 本實施例的流式表型檢測步驟與實施例1相同。
[0034] 本實施例的無菌檢測步驟與實施例1相同。
[0035] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種使用人廝帶間充質干細胞和人源羊膜構建細胞移植片的方法，其特征在于，包 括如下步驟： (1) 取新鮮采集的人羊膜和廝帶，清洗后將廝帶放入生理鹽水中浸泡備用； (2) 羊膜處理:先將清洗干凈的羊膜純性分離掉絨毛膜，再使用生理鹽水濕潤紗布將羊 膜擦拭干凈，然后將羊膜浸泡入含青霉素50~200U/na和硫酸鏈霉素50~200U/ml的生理鹽 水中浸泡0.5~1個小時后，放入無菌甘油中在2~8°C脫水，脫水時間不超過12小時，再轉入 無菌甘油中在-20°C保存備用； (3) 將步驟（1)浸泡好的廝帶剪成1~2cm長度的小段，清洗，然后將廝帶組織轉移至培 養皿中，培養皿中加生理鹽水至淹沒廝帶組織1/2處;將廝帶一端沿靜脈血管平行方向剪 口，用組織綴沿切口方向靜脈血管邊緣縱向撕開，將1根靜脈血管和兩根動脈血管剖離，用 組織綴去除羊膜，撕取華通氏膠，置于加有生理鹽水的離屯、管中； (4) 將華通氏膠，用生理鹽水充分洗涂，然后剪碎至1~3 大小，將剪碎的組織塊均 勻放置到無菌培養皿上，鋪平，沿培養皿邊緣緩慢加入5~IOml培養液，置于37°C、飽和濕 度、體積分數為5 %的C0:2解箱中培養，每S天更換一次培養液，培養15~20天后，直至觀察 到皿底上形成多個大小不一、細胞數量密集的細胞島時，則獲得原代WJC-MSCs; 巧)將培養液完全移出，向原代hUC-MSCs培養皿中加入質量百分比為0.05~0.25%的 膜酶1~3ml，放入37°C培養箱中消化，當觀察到貼壁細胞圓縮，且已經脫離瓶底后，加入5~ IOml培養液終止消化，將懸液移至離屯、管中，離屯、棄上清，離屯、管中加入新培養液，反復吹 打至其分散為單個細胞懸液，再把細胞懸液調節成4000~6000個細胞/cm 2體系接種于培養 瓶中置于37°C、飽和濕度、體積分數為5%的解箱中繼續培養，每3~4天更換培養液一次，至 融合度達80~90%，即得WJC-MSCs，將細胞收獲后凍存備用； (6) 取步驟(2)中凍存的羊膜，放入無菌生理鹽水中水化10~30分鐘，將水化好的羊膜 移至無菌培養皿中備用； (7) 將步驟(6)制備的羊膜平鋪于羊膜載體套環上，然后移入無菌培養皿中，放入37°C 的C0;3解箱中待用； (8) 將凍存的WJC-MSCs復蘇，將細胞密度調節至4000~6000個細胞/cm2體系接種于用步 驟(6)的培養皿中，置于37 °C、飽和濕度、體積分數為5 %的CO 3解箱中培養3~5天后，細胞 融合度達80~90 %即得細胞移植片。2. 根據權利要求1所述的一種使用人廝帶間充質干細胞和人源羊膜構建細胞移植片的 方法，其特征在于:所述的步驟(1)中含青霉素50~200U/ml和硫酸鏈霉素50~200U/ml的生 理鹽水是將注射用青霉素、硫酸鏈霉素按照濃度比1:1溶解入0.9%的氯化鋼注射液中得到 的。3. 根據權利要求1所述的一種使用人廝帶間充質干細胞和人源羊膜構建細胞移植片的 方法，其特征在于:所述的步驟（1)、（2)和步驟(3)中的清洗均為0.9%的氯化鋼注射液清 洗。4. 根據權利要求1所述的一種使用人廝帶間充質干細胞和人源羊膜構建細胞移植片的 方法，其特征在于:所述的步驟(4)中的培養液為購自Gibco公司DMEM/F12培養液加入10~ 20%的胎牛血清所得。
【專利摘要】一種使用人臍帶間充質干細胞（hUC-MSCs）和人源羊膜構建細胞移植片的方法，步驟如下：取新鮮采集的人羊膜和臍帶，把羊膜分離絨毛膜，經生理鹽水處理后凍存備用；將臍帶剪成小段，撕取華通氏膠；將華通氏膠剪碎放置無菌培養皿上加入培養液，置于孵箱中培養，獲得原代hUC-MSCs；向原代hUC-MSCs培養皿中加胰酶，經消化、孵箱中繼續培養，即得hUC-MSCs；將凍存備用的羊膜無菌水化后平鋪于羊膜載體套環上移入無菌培養皿中，將hUC-MSCs接種培養皿中，經孵箱中培養后，細胞融合度達80～90％即得細胞移植片。本發明制備的細胞片使其能夠在特定部位進行損傷修復，彌補了單獨使用hUC-MSCs或者羊膜治療的不足，為一些難治性疾病提供了新的治療策略，也為干細胞的臨床應用開辟了新的治療途徑。
【IPC分類】C12N5/0775, C12N5/073
【公開號】CN105647859
【申請號】
【發明人】秦方園, 翟亞萍, 王麗婭
【申請人】秦方園, 翟亞萍
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月25日