b和白介素2共同作用下培養14天后CIK細胞(CD3+/CD56+)的比例顯著增長(培養液為1%人血清，標記為61551!13+宿主細胞)。11^-1€[、1?1丫工0311^和白介素2擴增CIK細胞作為對照(培養液為1%人血清，標記為GT551H3);胎牛血清擴增CIK細胞作為對照(標記為1640+胎牛血清)。
[0031]圖3.PBMC中NK細胞體外擴增流式細胞儀數據圖。PBMC細胞在宿主細胞和白介素2共同作用下培養14天后NK細胞(⑶3-/⑶56+)的比例顯著增長(培養液為1%人血清，標記為GT551H3+宿主細胞)。白介素2擴增NK細胞作為對照(培養液為I %人血清，標記為GT551H3);胎牛血清擴增NK細胞作為對照(標記為1640+胎牛血清)。
[0032]圖4.(:11(細胞殺傷腫瘤細胞系圖。1^此細胞在宿主細胞、幾-1€[、1?1丫工0311^和白介素2共同作用培養14天后，擴增出的CIK細胞對K562、PC3、A549、HepG2腫瘤細胞的殺傷作用(培養液為1%人血清，標記為6了551!13+宿主細胞)。1卜1€[、正^丫、00311^和白介素2擴增PBMC中CIK細胞作為對照(培養液為I %人血清，標記為GT551H3);胎牛血清擴增CIK細胞作為對照(標記為1640+胎牛血清)。
[0033]圖5.CIK細胞殺傷TAMs細胞。PBMC在宿主細胞、IL-Ια、IFN- γ、CD3mAb和白介素2共同作用培養14天后，擴增后的CIK細胞對TAMs細胞的殺傷作用(培養液為I %人血清，標記為6丁551!13+宿主細胞)。幾-1€[、1?^丫丄0311^和白介素2擴增?8此中(:11(細胞作為對照(培養液為I %人血清，標記為GT551H3);胎牛血清擴增CIK細胞作為對照(標記為1640+胎牛血清)。
[0034]圖6.PBMC細胞在宿主細胞和白介素2共同作用培養14天后，擴增出的NK細胞對K562、PC3、A549、HepG2腫瘤細胞的殺傷作用(培養液為1%人血清，標記為GT551H3+宿主細胞)。白介素2擴增PBMC中NK細胞作為對照(培養液為1%人血清，標記為GT551H3);胎牛血清擴增NK細胞作為對照(標記為1640+胎牛血清)。
[0035]圖7.NK細胞殺傷TAMs細胞。PBMC在宿主細胞和白介素2共同作用培養14天后，擴增后的NK細胞對TAMs細胞的殺傷作用(培養液為1%人血清，標記為GT551H3+宿主細胞)。白介素2擴增PBMC中NK細胞作為對照(培養液為I %人血清，標記為GT551H3);胎牛血清擴增NK細胞作為對照(標記為1640+胎牛血清)。
[0036]圖8.(:11(細胞殺傷小鼠體內腫瘤細胞圖。？81(:細胞在宿主細胞、11^-1€[、1?^丫、CD3mAb和白介素2共同作用培養14天后，CIK細胞殺傷小鼠體內腫瘤細胞(培養液為I %人血清，標記為6了551!13+宿主細胞)；11^-1€[、1?^丫、0)311^和白介素2擴增?81(:中(:11(細胞作為對照(培養液為I %人血清，標記為GT551H3);胎牛血清擴增CIK細胞作為對照(標記為1640+胎牛血清)。
[0037]圖9.(:11(細胞治療腫瘤小鼠生存曲線。宿主細胞、幾-1€[、正1丫工0311^13擴增的(:11(細胞治療腫瘤小鼠，腫瘤小鼠生存曲線(培養液為10Zo人血清，標記為GT551H3+宿主細胞)。IL-1a、IFN- γ、CD3mAb和白介素2擴增PBMC中CIK細胞作為對照(培養液為I %人血清，標記為GT551H3);胎牛血清擴增CIK細胞作為對照。
[0038]圖10.NK細胞殺傷小鼠體內腫瘤細胞圖。PBMC宿主細胞和白介素2共同作用培養14天后，擴增后NK細胞殺傷小鼠體內腫瘤細胞(培養液為I %人血清，標記為GT551H3+宿主細胞)。白介素2擴增PBMC中NK細胞作為對照；胎牛血清擴增NK細胞作為對照(標記為1640+胎牛血清)。
[0039]圖11.NK細胞治療腫瘤小鼠生存曲線。宿主細胞和白介素2擴增的NK細胞治療腫瘤小鼠，腫瘤小鼠生存曲線(培養液為I %人血清，標記為GT551H3+宿主細胞)。白介素2擴增PBMC中NK細胞作為對照(培養液為I %人血清，標記為GT551H3);胎牛血清擴增NK細胞作為對照(標記為1640+胎牛血清)。
【具體實施方式】
[0040]本發明公開了一種無胎牛血清擴增激活淋巴細胞的方法，使用轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞，聯合多種蛋白質對淋巴細胞進行擴增激活，得到LAK淋巴細胞;其中轉染后的宿主細胞對淋巴細胞的擴增和激活有重要的作用，可以得到的足夠數量和功能的LAK細胞，可識別和摧毀腫瘤微環境中的腫瘤細胞、M2類型的單核細胞和CD19+B細胞，增強病人免疫反應。所述蛋白質A包含CD8a的功能片段和白介素21的功能片段;蛋白質B包含CD14的功能片段;蛋白質C包含CD19的功能片段;蛋白質D包含⑶86的功能片段;蛋白質E包含⑶163的功能片段;蛋白質F包含⑶137L的功能片段;其中，CD8a功能片段為在宿主細胞膜上表達的膜蛋白，CD8a功能片段連接白介素21功能片段后使得白介素21功能片段表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；CD14功能片段、CD19功能片段、CD86功能片段和CDl37功能片段均為膜蛋白。
[0041 ] 所述LAK淋巴細胞包括CIK淋巴細胞和NK淋巴細胞等，當擴增CIK淋巴細胞時，聯合的蛋白包括蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl、蛋白質Dl，其中蛋白質Al包含白介素2的功能片段、蛋白質BI包含IL-1a的功能片段、蛋白質Cl包含IFN-γ的功能片段、蛋白質Dl包含CD3mAb的功能片段。當擴增NK淋巴細胞時，聯合的蛋白質包括蛋白質Al。
[0042]蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F可以分別為CD8a-白介素21、0)14丄019、0)86丄0163、0)1371^，也可以是分別具有0)80-白介素21、0)14、0)19丄086、CD163、CD137L的功能片段的衍生蛋白；同理，蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl、蛋白質Dl可以分別為白介素2、IL-1a、IFN- γ、CD3mAb，也可以為分別具有白介素2、IL-la、IFN- γ、⑶3mAb功能片段的衍生蛋白<080-白介素21工014、0)19工086、0)163、0)1371^白介素2、11^-1€[、IFN- γ、CD3mAb的功能片段均為本領域的公知常識。
[0043]008(1-白介素21丄014、0)19、0)86、0)163和0)1371^也可以通過標準的操縱核苷酸編碼序列的方法來生產。例如，用特定的，非特定的定點突變或其他分子生物學技術來生產功能等同的，但一級結構不相同的多肽。簡單的一個或多個氨基酸修改如果不影響蛋白質的生化特性，這些通過氨基酸保守替換產生的蛋白質也在本發明保護的范圍之內。
[0044]上述宿主細胞可以為K562細胞。
[0045]所述的蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的劑量均為50pM_ΙΟΟΟρΜ。蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl的劑量均為10-1000IU/毫升，蛋白質Dl的劑量在10-1000納克/毫升，所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞=1-4:1，最優選地為1:1。
[0046]所述蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F為純化的蛋白質或由宿主細胞在細胞膜表面即時表達，蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl、蛋白質Dl為純化的蛋白質；所述純化是指質量分數在90%以上。在細胞膜上高水平表達的⑶8a-白介素21、CD14、CD19、⑶86和⑶137L可以通過本行業內的具有普通技能的人士所熟悉的技術來純化和分離。這些技術包括但不限于下面所列的方法:硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素。如有必要，蛋白質復性的方案可用來幫助純化表達的蛋白多肽。如果有必要，高效液相色譜法(HPLC)可作最后的純化步驟進一步純化蛋白質。本發明中在宿主細胞內表達的CD8a-白介素21、CD14、CD19、⑶86、CD163和⑶137L會有一部分分泌到細胞培養上清液中。本行業內的具有普通技能的人士都可以根據普通的生物化學技術來驗證。分泌到細胞培養上清液中的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶163和⑶137L也可以通過上述方法純化和分離。
[0047]細胞膜為0)8€[-白介素21、0)14、0)19、0)86、0)163和0)1371^提供了固相支撐，所述固相支撐包括但不僅僅限于金屬、玻璃、塑料、聚合物、顆粒、微小顆粒、磷脂、磷脂雙分子層、細胞膜和類似物。重要的是固相的表面能夠粘附上述蛋白質。
[0048]所述淋巴細胞選自外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、LAK細胞中的一種或多種，或者為外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、LAK細胞中的一種或多種和其它淋巴細胞的組合，或為白介素21、0)14、0)19、0)86、0)163、0)1371^、白介素2、11^-10、正^丫、CD3mAb中的一種或多種按照任意比組成的混合物作用于人體血管中的血液所產生的LAK淋巴細胞。其中的比例關系可