ti virus系統構建FIuc報告基因穩定表達的PC3細胞系。FlucLentivirus系統購自System B1sciences(美國，加州)，具體構建方法詳見產品介紹。PC3-Fluc細胞靜脈注射進嚴重免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)，21天后熒光檢測器檢測腫瘤的生長情況，隨機分組。擴增后的CIK細胞按照2xl06細胞/每只小鼠自尾靜脈注射，一周兩次。連續治療四周后停止治療，觀察治療效果。圖8和圖10顯示治療14天后腫瘤報告基因的熒光信號。宿主細胞擴增的CIK細胞和NK細胞對腫瘤細胞的生長有一定的抑制作用，比未用宿主細胞擴增的CIK細胞和NK細胞對PC3腫瘤細胞的殺傷作用強。圖9和11顯示，未用宿主細胞擴增的CIK和NK細胞對延長小鼠的存活率有一定的作用。而與對照組相比，用宿主細胞擴增的CIK細胞和NK細胞顯著提高了對腫瘤的治愈率，顯著延長了小鼠的存活率(p〈0.01)。這提示用GT-T551中加入宿主細胞擴增的CIK細胞和NK細胞可以用于臨床的腫瘤治療。
[0074]在本發明的實施例中提供了一個可以用來制成藥物的方案，按照這個方案制成的藥物可以有下面所描述的多種用途。這個方案包括:GT-T551中加入宿主細胞、IL-la、IFN-T、CD3mAb和白介素2共同作用擴增的CIK細胞;GT-T551中加入宿主細胞和白介素2共同作用擴增的NK細胞利用本方案擴增的CIK細胞和NK細胞適用于需要增強病人免疫力的各種情景。例如，擴增的CIK細胞和NK細胞對治療腫瘤特別有效，如急性髓細胞性白血病，慢性淋巴瘤白血病，前列腺腫瘤，惡性黑色素瘤和腎細胞惡性腫瘤，但不僅僅限于上述腫瘤。例如，擴增的CIK細胞和NK細胞對治療細菌，真菌或寄生蟲內感染特別有效。擴增的CIK細胞和NK細胞對治療病毒感染特別有效，如乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒但不僅僅限于上述病毒感染。擴增的CIK細胞和NK細胞可以顯著提高抗原的作用效果。
[0075]本發明中在GT-T551中加入宿主細胞、IFN-γ、CD3mAb和白介素2擴增的CIK細胞可以移植病人;在GT-T551中加入宿主細胞和白介素2擴增的NK細胞也可以移植病人。例如，宿主細胞、IL-la、IFN-γ、⑶3mAb和白介素2擴增激活CIK細胞的方法比不用宿主細胞擴增CIK細胞的方法更好，擴增的效率高2.1倍，細胞的數量可以達到1.0xlO1t3以上，滿足臨床治療的需求。宿主細胞和白介素2擴增激活NK細胞的方法比不用宿主細胞擴增NK細胞的方法更好，擴增的效率高2.2倍，細胞的數量可以達到1.0xlO1t3以上，
[0076]申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細特征以及方法，但本發明并不局限于上述詳細特征以及方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細特征以及方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用材料和步驟的等效替換以及輔助材料和步驟的增加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
【主權項】
1.一種無胎牛血清擴增激活LAK淋巴細胞的方法，其特征在于，使用轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞，聯合一種或多種蛋白質共同對淋巴細胞進行擴增激活，得到LAK淋巴細胞;所述蛋白質A包含CDSa的功能片段和白介素21的功能片段;蛋白質B包含CD14的功能片段;蛋白質C包含CD19的功能片段;蛋白質D包含CD86的功能片段;蛋白質E包含CD163的功能片段;蛋白質F包含CD137L的功能片段。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述LAK淋巴細胞為CIK淋巴細胞，聯合的蛋白質包括蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl、蛋白質Dl，所述蛋白質Al包含白介素2的功能片段、蛋白質BI包含IL-1a的功能片段、蛋白質Cl包含IFN-γ的功能片段、蛋白質Dl包含CD3mAb的功能片段;所述淋巴細胞選自外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、CIK細胞中的一種或多種，或者為外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、CIK細胞中的一種或多種和其它淋巴細胞的組合，或為白介素21、〇014、0)19、〇086、0)163、0)1371^、白介素2、11^-1€[、1卩1丫、⑶3mAb中的一種或多種按照任意比組成的混合物作用于人體血管中的血液所產生的CIK淋巴細胞。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)對轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞進行致死處理;所述致死處理選自強酸、強堿、輻照(劑量為lOOGy-lOOOGy)。 (2)在含有淋巴細胞的培養液中，加入步驟I處理后的宿主細胞、以及蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl、蛋白質Dl共同培養7天;使得所述的蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的量均為50pM-1000pM。蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl的量均為10-1000IU/毫升，蛋白質Dl的量在10-1000納克/毫升;所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10: I，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞=1-4: I，最優選地為1:1o (3)將培養后的培養液離心，獲取LAK淋巴細胞沉淀，并用培養液重懸； (4)加入輻照處理后的宿主細胞，使得宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞= 1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞= 1-4:1，最優選地為1:1培養7天;將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，即得到LAK淋巴細胞； 其中，所述培養液由由100體積的GT-T551和I體積的人血清組成。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述LAK淋巴細胞為NK細胞;聯合的蛋白質為蛋白質Al，蛋白質Al包含白介素2的功能片段。所述淋巴細胞選自外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、NK細胞中的一種或多種，或者為外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、NK細胞中的一種或多種和其它淋巴細胞的組合，或為白介素21工014、0)19工086、0)163、0)1371^、白介素2中的一種或多種按照任意比組成的混合物作用于人體血管中的血液所產生的NK淋巴細胞。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)對轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞進行致死處理;所述致死處理選自強酸、強堿、輻照(劑量為100Gy-1000Gy)。 (2)在含有淋巴細胞的培養液中，加入步驟I處理后的宿主細胞、以及蛋白質Al共同培養7天;使得所述的蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的量均為50pM-ΙΟΟΟρΜ。蛋白質Al的量為10-1000IU/毫升，所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10: I，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞=1-4: I，最優選地為1:1o (3)將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，并用培養液重懸； (4)加入輻照處理后的宿主細胞，使得宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞= 1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞= 1-4:1，最優選地為1:1培養7天;培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，即得到NK淋巴細胞； 其中，所述培養液由100體積的GT-T551和I體積的人血清組成。6.根據權利要求1?5所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為K562細胞。7.根據權利要求1?5所述的方法，其特征在于，所述蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F為純化的蛋白質或由宿主細胞在細胞膜表面即時表達，蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl、蛋白質Dl均為純化的蛋白質;所述純化是指質量分數在90%以上。8.根據權利要求1?5所述的方法，其特征在于，所述蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F分別為CD8a-白介素21復合物、CD14、CD19、CD86、CD163和CD137L，其中，CD8a為在宿主細胞膜上表達的膜蛋白，CD8a連接白介素21后使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；⑶14、⑶19、⑶86和⑶137均為膜蛋白。9.根據權利要求1?3所述的方法，其特征在于，轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞通過蛋白穩定表達系統得到。10.—種權利要求1-8中任一項所述方法制備得到的LAK淋巴細胞的應用，其特征在于，所述應用為，將LAK淋巴細胞用于制備治療癌癥、傳染性疾病、糖尿病、或器官移植的藥物。
【專利摘要】本發明公開了一種無胎牛血清擴增激活LAK細胞的方法。本發明的優點是與現有的胎牛培養基相比，本發明能夠避免因采用胎牛血清帶來的風險；與現有的無血清培養基相比，擴增和激活的免疫細胞的純度更高、擴增效率更高、殺傷腫瘤的能力更強。本發明擴增和激活的免疫細胞的純度、擴增效率、殺傷腫瘤的能力與現有的胎牛血清培養基相當。本發明擴增的免疫細胞在控制和緩解部分疾病的進展，如癌癥、傳染性疾病、糖尿病、或器官移植和乙肝方面具有廣闊的前景。
【IPC分類】A61P35/00, C12N5/0783, A61K35/17, A61P3/10
【公開號】CN105647863
【申請號】
【發明人】徐以兵, 鄭樹, 梁廷波, 朱莉莉, 胡薇蕾
【申請人】浙江大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月15日