以為任意比。本發明中的外周血單核細胞來自于外周血，臍帶血和骨髓，是脫離人體的組織。在其他應用中(例如，實驗研究)，脾臟和/或淋巴結也是合適的來源。
[0049]例如，淋巴細胞可以通過抽外周血和/或骨髓來獲得。淋巴細胞可以進一步經過純化得到LAK細胞。純化LAK的步驟和工藝是本行業內的具有普通技能的人士所熟悉的。淋巴細胞可以通過密度梯度離心的方式來分離血液或骨髓中的血紅細胞，淋巴細胞和其他細胞。LAK細胞可以利用抗體介導的親和制備方法進一步純化，例如抗體結合磁珠法。純化淋巴細胞并不要求純化的淋巴細胞絕對純，而是指純化的細胞比其在來源組織中所占的比例更高。通常情況下，純化的淋巴細胞至少代表總數的50%，或者60%，或者更高。
[0050]為了確保長期，高收益的生產重組白介素21丄014、0)19丄086、0)163和0)1371^，本發明采用了蛋白穩定表達系統。構建蛋白穩定表達系統是本行業內的具有普通技能的人士所通常采用的技術，具體方法可詳見(Imai等Leukemia，2004，18，676-684)。例如，K562細胞系轉錄了穩定表達⑶8α-白介素21、⑶14、CD19、⑶86和⑶137L的表達載體，這個載體中含有病毒啟動子和選擇標記基因，如抗生素抗性基因。CDSa是一種在細胞膜上表達的膜蛋白，⑶8α基因連接白介素21基因后使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；CD14、⑶19、⑶86、⑶163和⑶137L為膜蛋白。外源表達載體進入宿主細胞后，用恰當的方法激活啟動子，培養細胞一段時間后即可以得到在細胞膜上高水平表達的白介素21工014、0019工086和⑶137L多肽。這些方法是本行業內的具有普通技能的人士通常理解的方法。
[0051]本發明中的白介素2、白介素21丄014、0)19、0)86丄0163、0)1371^、11^-10、1卩^丫、CD3mAb來源于人，但不僅僅限于人，如注射或處理的對象是其它物種，如小鼠，大鼠，猴子等等，也可以是其它物種的白介素2、白介素21、0)14、0)19工086、0)163、0)1371^、11^-1€[、正^γ 和CD3mAb0
[0052]除非另有說明，本發明中所有的技術和科學詞匯的含義是本行業內的具有普通技能的人士通常理解的含義。常用術語的定義在所有分子生物學書中可以找到，例如，Benjamin Lewin,Genes VIII,Oxford University Press,2004(ISBN 0-13-145140-5)。
[0053 ]上述擴增激活LAK淋巴細胞的方法，具體可以包括以下步驟:
[0054](I)采用現有的技術對宿主細胞進行轉染，然后通過高速離心的方法收集轉染后的宿主細胞，并對轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞進行致死處理，所述致死處理選自強酸、強堿、輻照(劑量為10Gy-1OOOGy);所述輻照的劑量為 I OOGy-1 OOOGy。
[0055](2)在含有淋巴細胞的培養液中，加入步驟I處理后的宿主細胞、以及蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl、蛋白質Dl共同培養7天;使得所述的蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的劑量均為50pM-1000pM。蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl的劑量均為10-1000IU/毫升，蛋白質Dl的劑量在10-1000納克/毫升;所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞= 1-4:1，最優選地為1:1。
[0056](3)將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，并用培養液重懸；
[0057](4)加入輻照處理后的宿主細胞，使得宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10: I，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞=1-4: I，最優選地為I: I培養7天;經培養后，輻照后的宿主細胞破裂，將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，即得到CIK淋巴細胞；
[0058]其中，所述培養液由100體積的GT-T551和I體積的人血清組成；
[0059]本發明利用的方法可以得到的足夠數量和功能的LAK細胞，可應用于識別和摧毀腫瘤微環境中的腫瘤細胞、M2類型的單核細胞和CD19+B細胞，增強病人免疫反應。制備得到的LAK淋巴細胞可用于制備治療癌癥、傳染性疾病、糖尿病、或器官移植的藥物。
[0060]所述癌癥優選地為肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、直腸癌、急性髓細胞性白血病、慢性淋巴瘤白血病、前列腺腫瘤、惡性黑色素瘤和腎細胞惡性腫瘤中的一種或至少兩種；
[0061]所述傳染性疾病優選為細菌、病毒、真菌或寄生蟲感染，更優選地為乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒感染；
[0062]所述糖尿病為I型糖尿病或II型糖尿病，更優選地為I型糖尿病；
[0063 ] 所述器官移植為肺移植、腎移植、肝移植，更優選地為肝移植。
[0064]本發明采用宿主細胞擴增的LAK細胞，可以用來進行自體移植，也可以進行異體移植。在受捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原與捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原相匹配的前提下，捐助人被激活和擴增的細胞可以通過靜脈滴注的方式注入到被捐助人的血管中。在某些應用中，LAK細胞系也可以通過宿主細胞進行激活和擴增。擴增的細胞系用于制備治療疾病的藥物也是本發明的保護范圍。
[0065]下面結合附圖并通過【具體實施方式】來進一步說明本發明的技術方案。
[0066]實施例1擴增未經純化的外周血淋巴細胞中的CIK和NK細胞
[0067]本發明的擴增方案不僅可以擴增純化的CIK和NK細胞，還可以擴增未經過純化的CIK和NK細胞。
[0068]健康捐獻人的PBMC培養在GT-T551中，輔以1%的人血清。在培養液中加入宿主細胞(按照Imai等Leukemia，2004，18，676-684所述方法對K562細胞轉染后，進行輻射致死)、IL-lcuIFN-γ、CD3mAb后共同培養7天。7天后離心，用等量的培養液重懸，加入經過10Gy輻照的宿主細胞，再培養7天，如圖1A所示。未加入宿主細胞的擴增方案作為對照組。CIK細胞在宿主細胞、11-1€(、1?^丫、00311^13和白介素2的共同作用下，數量顯著增加，純度顯著提高。CIK細胞數量在7天時進入對數生長期，14天的時約增長了2100倍。宿主細胞對CIK細胞生長的擴增作用明顯強于未加宿主細胞組，14天時增長了5.1倍。如圖2所示，在宿主細胞、IL-1a、IFN- γ、⑶3mAb和白介素2共同作用下，第14天時76.3 %的淋巴細胞變成CIK細胞，未加宿主細胞的對照組外周血淋巴細胞有2.3 %細胞變成CIK細胞。
[0069]健康捐獻人的PBMC培養在GT-T551中，輔以1%的人血清。在培養液中加入宿主細胞(按照Imai等1^111?51^&，2004，18，676-684所述方法對1(562細胞轉染后，進行輻射致死)和白介素2后共同培養7天。7天后離心，用等量的培養液重懸，加入經過10Gy輻照的宿主細胞，再培養7天，如圖1B所示。未加入宿主細胞的擴增方案作為對照組。NK細胞在宿主細胞和白介素2的共同作用下，數量顯著增加，純度顯著提高。NK細胞數量在7天時進入對數生長期，14天的時約增長了2100倍。宿主細胞對NK細胞生長的擴增作用明顯強于未加宿主細胞組，14天時增長了5.1倍。如圖3所示，在宿主細胞和白介素2共同作用下，第14天時76.3%的淋巴細胞變成NK細胞，未加宿主細胞的對照組外周血淋巴細胞有2.3%細胞變成NK細胞。
[0070]實施例2擴增后的CIK和NK細胞對腫瘤細胞系的裂解作用和對小鼠體內腫瘤的。[0071 ]以前的研究表明，給腫瘤模型小鼠注射CIK細胞能夠增強小鼠的抗腫瘤能力，延緩小鼠的壽命。本實施例采用GT-T551中加入宿主細胞、IL-la、IFN-γ、CD3mAb和白介素2共同作用擴增的CIK細胞，通過比較CIK細胞抗腫瘤的效果，來研究擴增后的CIK細胞抗腫瘤的可行性。將健康捐獻者的淋巴細胞中分離出來后，加入宿主細胞、IL-la、IFN-γ、CD3mAb和白介素2共同作用擴增CIK細胞，第7天和第14天時分別加入宿主細胞，所用劑量參考實施例一。未加入宿主細胞擴增的CIK細胞作為對照組。宿主細胞擴增的CIK細胞比未用宿主細胞擴增的CIK細胞對K562、PC3、A549、HepG2細胞的殺傷作用顯著增強，對腫瘤相關巨噬細胞的殺傷作用也則顯著增強，P<0.05，如圖4和圖5所示。
[0072]給腫瘤模型小鼠注射NK細胞能夠增強小鼠的抗腫瘤能力，延緩小鼠的壽命。本實施例采用在GT-T551中加入宿主細胞和白介素2共同作用擴增的NK細胞，通過比較NK細胞抗腫瘤的效果，來研究擴增后的CIK細胞抗腫瘤的可行性。將健康捐獻者的淋巴細胞中分離出來后，加入宿主細胞和白介素2共同作用擴增NK細胞，第7天和第14天時分別加入宿主細胞，所用劑量參考實施例一。未加入宿主細胞擴增的NK細胞作為對照組。宿主細胞擴增的NK細胞比未用宿主細胞擴增的CIK細胞對K562、PC3、A549、HepG2細胞的殺傷作用顯著增強，對腫瘤相關巨噬細胞的殺傷作用也則顯著增強，P<0.05，如圖6和7所示。
[0073]體外用Len