胞對TAMs細胞的殺傷作用。a-半乳糖神經酰胺和和白介素2擴增PBMC中iNKT細胞作為對照；
[0027]圖6.1NKT細胞殺傷小鼠體內腫瘤細胞圖JBMC細胞在宿主細胞、a-半乳糖神經酰胺和白介素2共同作用培養14天后，iNKT細胞對小鼠體內的腫瘤的殺傷作用。
[0028]圖7.1NKT細胞治療腫瘤小鼠生存曲線圖，宿主細胞和a-半乳糖神經酰胺共同擴增的iNKT細胞治療腫瘤小鼠，腫瘤小鼠生存曲線。a-半乳糖神經酰胺擴增的iNKT細胞和未治療組作為對照。
【具體實施方式】
[0029]本發明提供一種iNKT細胞的擴增激活方法，該方法使用轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞，聯合蛋白質Al、a-半乳糖神經酰胺共同對淋巴細胞進行擴增激活，得到iNKT淋巴細胞;其中轉染后的宿主細胞對淋巴細胞的擴增和激活有重要的作用，可以得到的足夠數量和功能的iNKT細胞，可識別和摧毀腫瘤微環境中的腫瘤細胞、M2類型的單核細胞和CD19+B細胞，增強病人免疫反應。所述蛋白質A包含CD8a的完整片段和白介素21的功能片段;蛋白質B包含CD14的功能片段;蛋白質C包含CD19的功能片段;蛋白質D包含CD86的功能片段;蛋白質E包含CD163的功能片段;蛋白質F包含CD137L的功能片段;其中，CD8a功能片段為在宿主細胞膜上表達的膜蛋白，CD8a功能片段連接白介素21功能片段后使得白介素21功能片段表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；CD14功能片段、CD19功能片段、CD86功能片段和CD137L功能片段均為膜蛋白；蛋白質Al包含白介素2的功能片段。即蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F以及蛋白質Al可以分別為〇08<1-白介素21工014、0)19工086、0)163、0)1371^白介素2，也可以是分別具有0)8€[-白介素21、CD14、CD19、CD86、CD163、CD137L、白介素2的功能片段的衍生蛋白；CD8a-白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶163、⑶137L、白介素2的功能片段均為本領域的公知常識。
[0030]008(1-白介素21丄014、0)19、0)86、0)163和0)1371^也可以通過標準的操縱核苷酸編碼序列的方法來生產。例如，用特定的，非特定的定點突變或其他分子生物學技術來生產功能等同的，但一級結構不相同的多肽。簡單的一個或多個氨基酸修改如果不影響蛋白質的生化特性，這些通過氨基酸保守替換產生的蛋白質也在本發明保護的范圍之內。
[0031]上述宿主細胞可以為K562細胞。
[0032]所述的蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的劑量均為50pM-ΙΟΟΟρΜ。蛋白質Al和α-半乳糖神經酰胺的劑量在1-100納克/毫升。所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞= 1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞=1_4:1，最優選地為1:1。
[0033]所述蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F為純化的蛋白質或由宿主細胞在細胞膜表面即時表達，蛋白質Al、蛋白質B1、蛋白質Cl、蛋白質Dl為純化的蛋白質；所述純化是指質量分數在90%以上。在細胞膜上高水平表達的⑶8α-白介素21、CD14、CD19、⑶86和⑶137L可以通過本行業內的具有普通技能的人士所熟悉的技術來純化和分離。這些技術包括但不限于下面所列的方法:硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素。如有必要，蛋白質復性的方案可用來幫助純化表達的蛋白多肽。如果有必要，高效液相色譜法(HPLC)可作最后的純化步驟進一步純化蛋白質。本發明中在宿主細胞內表達的CD8a-白介素21、CD14、CD19、⑶86、CD163和⑶137L會有一部分分泌到細胞培養上清液中。本行業內的具有普通技能的人士都可以根據普通的生物化學技術來驗證。分泌到細胞培養上清液中的跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶163和⑶137L也可以通過上述方法純化和分離。
[0034]細胞膜為⑶8a-白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶163和⑶137L提供了固相支撐，所述固相支撐包括但不僅僅限于金屬、玻璃、塑料、聚合物、顆粒、微小顆粒、磷脂、磷脂雙分子層、細胞膜和類似物。重要的是固相的表面能夠粘附上述蛋白質。
[0035]所述淋巴細胞選自外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、iNKT細胞(純化是指iNKT細胞為細胞總數的50%以上)中的一種或多種，或者為外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、iNKT細胞中的一種或多種和其它淋巴細胞的組合，或為⑶8a-白介素21、⑶14、CD19、⑶86、CD163、CD137L、白介素2中的一種或多種按照任意比組成的混合物作用于人體血管中的血液所產生的淋巴細胞。作為本領域的公知常識，上述蛋白質直接注射入人體，所用劑量在
[0036]例如，淋巴細胞可以通過抽外周血和/或骨髓來獲得。淋巴細胞可以進一步經過純化得到iNKT細胞。純化iNKT細胞的步驟和工藝是本行業內的具有普通技能的人士所熟悉的。淋巴細胞可以通過密度梯度離心的方式來分離血液或骨髓中的血紅細胞，淋巴細胞和其他細胞。iNKT細胞可以利用抗體介導的親和制備方法進一步純化，例如抗體結合磁珠法。純化淋巴細胞并不要求純化的淋巴細胞絕對純，而是指純化的細胞比其在來源組織中所占的比例更高。通常情況下，純化的淋巴細胞至少代表總數的50%，或者60%，或者更高。
[0037]為了確保長期，高收益的生產重組白介素21丄014、0)19丄086、0)163和0)1371^，本發明采用了蛋白穩定表達系統。構建蛋白穩定表達系統是本行業內的具有普通技能的人士所通常采用的技術，具體方法可詳見(Imai等Leukemia，2004，18，676-684)。例如，K562細胞系轉錄了穩定表達⑶8α-白介素21、⑶14、CD19、⑶86和⑶137L的表達載體，這個載體中含有病毒啟動子和選擇標記基因，如抗生素抗性基因。CDSa是一種在細胞膜上表達的膜蛋白，⑶8α基因連接白介素21基因后使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；CD14、⑶19、⑶86、⑶163和⑶137L為膜蛋白。外源表達載體進入宿主細胞后，用恰當的方法激活啟動子，培養細胞一段時間后即可以得到在細胞膜上高水平表達的白介素21工014、0019工086和⑶137L多肽。這些方法是本行業內的具有普通技能的人士通常理解的方法。
[0038]本發明中的白介素2、白介素21丄014、0)19、0)86、0)163、0)1371^、來源于人，但不僅僅限于人，如注射或處理的對象是其它物種，如小鼠，大鼠，猴子等等，也可以是其它物種的白介素2、白介素21、0)14、0)19、0)86、0)163、0)137匕
[0039]除非另有說明，本發明中所有的技術和科學詞匯的含義是本行業內的具有普通技能的人士通常理解的含義。常用術語的定義在所有分子生物學書中可以找到，例如，Benjamin Lewin,Genes VIII,Oxford University Press,2004(ISBN 0-13-145140-5)。
[0040]上述擴增激活淋巴細胞的方法，具體可以包括以下步驟:
[0041](I)對轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞進行致死處理;所述致死處理選自強酸、強堿、輻照(劑量為100Gy-1000Gy)。
[0042](2)在含有淋巴細胞的