培養液中，加入步驟I處理后的宿主細胞、以及蛋白質Α1、α-半乳糖神經酰胺共同培養7天;使得所述的蛋白質Α、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質Ε、蛋白質F的量均為50ρΜ-1000ρΜ。蛋白質Al和α-半乳糖神經酰胺的劑量在1-100納克/毫升。所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞= 1-4:1，最優選地為1:1。
[0043](3)經培養后，輻照后的宿主細胞破裂，將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，并用培養液重懸；
[0044](4)加入輻照處理后的宿主細胞，使得宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10: I，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞=1-4: I，最優選地為I: I培養7天;經培養后，輻照后的宿主細胞破裂，將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，即得到iNKT淋巴細胞；
[0045]其中，所述培養液由100體積的1640培養液和10體積的胎牛血清組成。本發明中宿主細胞對外周血單核細胞(PBMC)和iNKT細胞擴增和激活有重要的作用。擴增和激活后產生的iNKT細胞有重要的醫療作用。本發明利用的方法可以得到的足夠數量和功能的iNKT細胞，可應用于識別和摧毀腫瘤微環境中的腫瘤細胞、M2類型的單核細胞和CD19+B細胞，增強病人免疫反應的方法。制備得到的iNKT淋巴細胞可用于制備治療癌癥、傳染性疾病、糖尿病、或器官移植的藥物。
[0046]所述癌癥優選地為肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、直腸癌、急性髓細胞性白血病、慢性淋巴瘤白血病、前列腺腫瘤、惡性黑色素瘤和腎細胞惡性腫瘤中的一種或至少兩種；
[0047]所述傳染性疾病優選為細菌、病毒、真菌或寄生蟲感染，更優選地為乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒感染；
[0048]所述糖尿病為I型糖尿病或II型糖尿病，更優選地為I型糖尿病；
[0049 ] 所述器官移植為肺移植、腎移植、肝移植，更優選地為肝移植。
[0050]本發明采用宿主細胞擴增的iNKT細胞，可以用來進行自體移植，也可以進行異體移植。在受捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原與捐助人(成年人或者未成年人)的組織相容性抗原以及血液抗原相匹配的前提下，捐助人被激活和擴增的細胞可以通過靜脈滴注的方式注入到被捐助人的血管中。在某些應用中，iNKT細胞系也可以通過宿主細胞進行激活和擴增。擴增的細胞系用于制備治療疾病的藥物也是本發明的保護范圍。
[0051]下面結合附圖并通過【具體實施方式】來進一步說明本發明的技術方案。
[0052]下面對本發明的實施作具體說明:
[0053]以1(562細胞系轉錄穩定表達0)8€[-白介素21工014、0)19工086、0)163和0)1371^的表達載體，CD8a為在細胞膜上表達的膜蛋白，CD8a基因連接白介素21基因后使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；而⑶14、⑶19、⑶86、⑶163和⑶137L為膜蛋白，載體中含有病毒啟動子和選擇標記基因；當外源表達載體進入宿主細胞后，激活啟動子，培養K562細胞一段時間，即可以得到在細胞膜上的白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶163和⑶137L多肽;經培養后的1(562細胞膜上具有表達跨膜白介素21、0)14工019、0)86工0163和0)1371^的細胞，通過強酸，強堿、和/或輻照、及通過高速離心收集宿主細胞;或對K562細胞的依次用硫酸銨或乙醇沉淀，強酸提取，陰離子或陽離子交換色譜，疏水作用層析，親和層析，羥基磷灰石色譜法，色譜法和凝集素進行純化收集;將上述離心收集的宿主細胞后與淋巴共同培養，得到iNKT細胞。
[0054]實施例1擴增純化的iNKT細胞。
[0055]將純化后的iNKT細胞(lxlO6，其中iNKT細胞占50%以上)培養在RPMI1640中，輔以10 %的人血清。在培養液中加入福照致死后的宿主細胞(按照Imai等Leukemi a，2004，18，676-684所述方法對K562細胞轉染后，進行輻射致死)、α-半乳糖神經酰胺(10納克/毫升)和白介素2(10納克/毫升)后培養7天。7天后離心，用等量的培養液重懸，加入經過輻照的宿主細胞，再培養7天，如圖1所示。α-半乳糖神經酰胺(10納克/毫升)和白介素2(10納克/毫升)作為對照組。如圖1所示，iNKT細胞在宿主細胞和α-半乳糖神經酰胺(10納克/毫升)和白介素2(10納克/毫升)的共同作用下，數量顯著增加。細胞數量的增加可以通過插入胸苷的方法來測定。胸苷插入之后細胞繼續培養12小時，然后再開始測量細胞數量的變化。在宿主細胞:iNKT淋巴細胞=1:1濃度的作用下iNKT細胞數量在7天時進入對數生長期，14天的時約增長了4500倍。在加入宿主細胞后，iNKT細胞在1-100納克/毫升的白介素2作用下即可開始增長。宿主細胞、α-半乳糖神經酰胺和白介素2對于促進iNKT細胞生長的作用明顯強于α-半乳糖神經酰胺和白介素2，14天時約強9.2倍。
[0056]實施例2擴增未經純化的外周血淋巴細胞中的iNKT細胞
[0057]本發明的擴增方案不僅可以擴增純化的iNKT細胞，還可以擴增未經過純化的iNKT淋巴細胞。健康捐獻人的PBMC培養在RPMI1640中，輔以10 %的人血清。在培養液中加入宿主細胞(按照Imai等Leukemia，2004，18，676-684所述方法對K562細胞轉染后，進行輻射致死)、α_半乳糖神經酰胺(10納克/毫升)和白介素2(10納克/毫升)后共同培養7天。7天后離心，用等量的培養液重懸，加入經過10Gy輻照的宿主細胞，再培養7天，如圖2所示。未加入宿主細胞的擴增方案作為對照組。iNKT細胞在宿主細胞、α-半乳糖神經酰胺和白介素2的共同作用下，數量顯著增加，純度顯著提高。iNKT細胞數量在7天時進入對數生長期，14天的時約增長了2100倍。宿主細胞、α-半乳糖神經酰胺和白介素2對iNKT細胞生長的擴增作用明顯強于未加宿主細胞組，14天時增長了5.1倍。
[0058]如圖3所示，在宿主細胞、α-半乳糖神經酰胺和白介素2共同作用下，第14天時76.3%的淋巴細胞變成iNKT細胞(CD3+/Va24-Jal8+)，未加宿主細胞的對照組外周血淋巴細胞有2.3%細胞變成iNKT細胞。在宿主細胞、α-半乳糖神經酰胺和白介素2共同作用下，第21天時98.5%的淋巴細胞變成iNKT細胞，未加宿主細胞的對照組外周血淋巴細胞有4.3%細胞變成iNKT細胞。
[0059]實施例3擴增后的iNKT細胞對腫瘤細胞和腫瘤微環境中的腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)的裂解作用。
[0060]在宿主細胞、α-半乳糖神經酰胺和白介素2共同作用下擴增的iNKT細胞對腫瘤細胞有著非常明顯的裂解作用。以前的研究表明，給腫瘤模型小鼠注射iNKT細胞能夠增強小鼠的抗腫瘤能力，延緩小鼠的壽命。本實施例采用宿主細胞、α-半乳糖神經酰胺和白介素2共同作用擴增的iNKT細胞，通過比較iNKT細胞抗腫瘤的效果，來研究擴增后的iNKT細胞抗腫瘤的可行性。
[0061]將健康捐獻者的淋巴細胞中分離出來后，加入宿主細胞、α-半乳糖神經酰胺和白介素2共同作用擴增iNKT細胞，第7天和第14天時分別加入宿主細胞，所用劑量參考實施例一。未加入宿主細胞擴增的iNKT細胞作為對照組。宿主細胞擴增的iNKT細胞比未用宿主細胞擴增的iNKT細胞對K562、PC3、A549、HepG2細胞的殺傷作用顯著增強，對腫瘤相關巨噬細胞的殺傷作用也則顯著增強