，P < 0.05，如圖4和圖5所示。
[0062]體外用Lenti virus系統構建FIuc報告基因穩定表達的PC3細胞系。FlucLentivirus系統購自System B1sciences(美國，加州)，具體構建方法詳見產品介紹。PC3-Fluc細胞靜脈注射進嚴重免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)，21天后熒光檢測器檢測腫瘤的生長情況，隨機分組。擴增后的iNKT細胞按照2xl06細胞/每只小鼠自尾靜脈注射，一周兩次。連續治療四周后停止治療，觀察治療效果。圖6顯示治療14天后腫瘤報告基因的熒光信號。宿主細胞擴增的iNKT細胞對腫瘤細胞的生長有一定的抑制作用，比未用宿主細胞擴增的iNKT細胞對PC3腫瘤細胞的殺傷作用強。圖7顯示，未用宿主細胞擴增的iNKT細胞對延長小鼠的存活率有一定的作用。而與對照組相比，用宿主細胞擴增的iNKT細胞顯著提高了對腫瘤的治愈率，顯著延長了小鼠的存活率(p〈0.01)。這提示用宿主細胞擴增的iNKT細胞可以用于臨床的腫瘤治療。
[0063]在本發明的實施例中提供了一個可以用來制成藥物的方案，按照這個方案制成的藥物可以有下面所描述的多種用途。這個方案包括:轉染⑶8α-白介素21、CD14、⑶19、⑶86、⑶163和⑶137L蛋白質的Κ562宿主細胞、α-半乳糖神經酰胺和白介素2共同作用擴增的iNKT細胞。利用本方案擴增的iNKT細胞適用于需要增強病人免疫力的各種情景。例如，擴增的iNKT細胞對治療腫瘤特別有效，如急性髓細胞性白血病，慢性淋巴瘤白血病，前列腺腫瘤，惡性黑色素瘤和腎細胞惡性腫瘤，但不僅僅限于上述腫瘤。例如，擴增的iNKT細胞對治療細菌，真菌或寄生蟲內感染特別有效。擴增的iNKT細胞對治療病毒感染特別有效，如乙肝病毒，甲肝病毒和艾滋病毒但不僅僅限于上述病毒感染。擴增的NK細胞可以顯著提高抗原的作用效果。
[0064]本發明中轉染0)8<1-白介素21、0014、0)19、0086、0)163和0)1371^蛋白質的1(562宿主細胞、α-半乳糖神經酰胺和白介素2可以用來擴增NK細胞，也可以移植病人。體外擴增的NK細胞可移植病人。例如，跨膜白介素21、⑶14、⑶19、⑶86、⑶137L和低劑量白介素2擴增激活NK細胞的方法比僅用α-半乳糖神經酰胺和白介素2擴增iNKT細胞的方法，擴增的效率高9.2倍。21天后，iNKT細胞的純度可以達到95%，細胞的數量可以達到1.0x1iq以上，滿足臨床治療的需求。
[0065]申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細特征以及方法，但本發明并不局限于上述詳細特征以及方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細特征以及方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用材料和步驟的等效替換以及輔助材料和步驟的增加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。
【主權項】
1.一種iNKT淋巴細胞的擴增激活方法，其特征在于，使用轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞，聯合蛋白質Al、α-半乳糖神經酰胺共同對淋巴細胞進行擴增激活，得到iNKT淋巴細胞;所述蛋白質A包含CDSa的完整片段和白介素21的功能片段;蛋白質B包含CD14的功能片段;蛋白質C包含CD19的功能片段;蛋白質D包含CD86的功能片段;蛋白質E包含CD163的功能片段;蛋白質F包含CD137L的功能片段;蛋白質Al包含白介素2的功能片段。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞為K562細胞。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的劑量均為50pM-1000pM。蛋白質Al和α-半乳糖神經酰胺的劑量在1-100納克/毫升。所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞=1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞= 1-4:1，最優選地為1:1。4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白質Α、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F為純化的蛋白質或由宿主細胞在細胞膜表面即時表達，蛋白質Al為純化的蛋白質;所述純化是指質量分數在90%以上。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述蛋白質Α、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質Ε、蛋白質F分別為CD8a-白介素21復合物、CD14、CD19、CD86、CD163和CD137L，其中，CD8a為在宿主細胞膜上表達的膜蛋白，CD8a連接白介素21后使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；⑶14、⑶19、⑶86和⑶137L均為膜蛋白。6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述淋巴細胞選自外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、iNKT細胞中的一種或多種，或者為外周血淋巴細胞、臍帶血淋巴細胞、iNKT細胞中的一種或多種和其它淋巴細胞的組合，或為白介素21、0014、0)19、0086、00163、CD137L、白介素2中的一種或多種按照任意比組成的混合物作用于人體血管中的血液所產生的淋巴細胞。7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞通過蛋白穩定表達系統得到。8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)對轉染了蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的宿主細胞進行致死處理;所述致死處理選自強酸處理、強堿處理、輻照(劑量為lOOGy-lOOOGy)處理。 (2)在含有淋巴細胞的培養液中，加入步驟I處理后的宿主細胞、以及蛋白質Al、a_半乳糖神經酰胺共同培養7天;使得所述的蛋白質A、蛋白質B、蛋白質C、蛋白質D、蛋白質E、蛋白質F的量均為50pM-1000pM。蛋白質Al和a-半乳糖神經酰胺的劑量在1-100納克/毫升。所述宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞= 1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞= 1-4:1，最優選地為1:1。 (3)經培養后，輻照后的宿主細胞破裂，將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，并用培養液重懸； (4)加入輻照處理后的宿主細胞，使得宿主細胞與淋巴細胞的用量比例(數量比)為宿主細胞:淋巴細胞= 1-10:1，更優選地，為宿主細胞:淋巴細胞= 1-4:1，最優選地為1:1培養7天;經培養后，輻照后的宿主細胞破裂，將培養后的培養液離心，獲取存活的淋巴細胞沉淀，即得到iNKT淋巴細胞； 其中，所述培養液由100體積的1640培養液和10體積的胎牛血清組成。9.一種權利要求1-8中任一項所述方法制備得到的iNKT淋巴細胞的應用，其特征在于，所述應用為，將iNKT淋巴細胞用于制備治療癌癥、傳染性疾病、糖尿病、或器官移植的藥物。
【專利摘要】本發明公開了一種使用轉染功能蛋白質的宿主細胞,聯合多種蛋白質擴增激活iNKT淋巴細胞的方法。本發明的優點是與現有的方法相比，本發明擴增和激活的iNKT細胞的純度更高、擴增效率更高、殺傷腫瘤和腫瘤微環境中TAMs的能力更強。本發明在控制和緩解部分疾病的進展,如腫瘤、糖尿病及器官移植的排斥方面具有廣闊的前景。
【IPC分類】A61P3/10, A61K35/17, C12N5/0783, A61P35/00, A61P43/00
【公開號】CN105647864
【申請號】
【發明人】徐以兵, 鄭樹, 梁廷波, 朱莉莉, 胡薇蕾
【申請人】浙江大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月15日