程從中制備出自體血清；
[0032]2)配置細胞誘導培養基備用
[0033]DC細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度5-10%的步驟I)中制備的自體血清、80-150 IU/ml 的 IL-4 和800-1500 IU/ml 的 GM-CSF ；
[0034]CIK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有有體積濃度5-10 %的步驟I)中制備的自體血清和300-1000IU/ml的IL-2;
[0035]NK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度5-10%的步驟I)中制備的自體血清、300-1000IU/ml 的 IL-2、20_200ng/ml 的 IL-12、50_200ng/ml 的 IL-15 ；
[0036]3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養瓶中，加入40-50ml免疫細胞培養基、并加入步驟I)中制備的2-4ml的自體血清，孵育l-2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入40-50ml DC細胞誘導培養基，誘導DC細胞；
[0037]4)將步驟3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的PBMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前4-12小時預包被4-10ug的⑶3McAb的T-175細胞培養瓶，以及預包被20-40ug的CD16McAb的T-175細胞培養瓶中；在預包被CD3McAb的培養瓶中加入100ml CIK細胞誘導培養基和終濃度500-1000IU/ml的IFN-r，誘導CIK細胞；在預包被CD16McAb的培養瓶中加入100ml NK細胞誘導培養基以及終濃度500-1000IU/ml的IFN_r，誘導NK細胞；
[0038]4)培養第3天，在CIK細胞誘導體系中補加5-10ml的自體血清、30000-100000IU的IL-2繼續培養；
[0039]5)培養第4天，在DC細胞誘導體系中加入30-40ml DC細胞誘導培養基，混合均勻后培養;同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0040]6)培養第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0041 ] 7)培養第6天，在DC細胞誘導體系中按照終濃度500-1000IU/ml加入TNF-a，混合均勻后繼續培養；
[0042]8)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液加入到一個1.8升容量的細胞培養袋中并在培養體系中加入200ml CIK細胞誘導培養基并加入4-10ug的⑶3McAb以及15-30ug的CD28McAb;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養袋中與CIK細胞共培養；同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養袋中，并在培養體系中并加入400ml的NK細胞誘導培養基以及20-40ug的⑶16McAb，混合均勻后繼續培養；
[0043]9)第9天，在DC+CIK細胞共培養的培養袋中加入400mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0044]10)第11天在DC+CIK細胞共培養的培養袋中加入800ml CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞的培養袋中加入100ml的NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0045]11)第14天取出800-1000ml的DC+CIK細胞共培養的培養袋中細胞懸液收獲細胞，并加入400-600ml的CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時取出800-1000ml的NK細胞的培養袋中細胞懸液收獲細胞，加入400-600ml的NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0046]12)第17天，將DC+CIK細胞共培養的培養袋及NK細胞的培養袋中的所有細胞收獲。
[0047]所述免疫細胞培養基為美天旎公司生產的TexMACS免疫細胞培養基。
[0048]將獲得的血漿在56°C的條件下滅活30-35min后，通過-20°C完全凍結，在20-24°C融化后，通過10000-12000rpm的條件下離心5-10min，使用0.4um的濾膜過濾上清后獲得自體血清。
[0049]上述的制備方法制得的聯合免疫細胞。
[0050]本發明通過一整套配合免疫細胞培養基及多種細胞因子，使用自體血清的情況下對DC細胞、CIK細胞及NK細胞進行分別誘導。并在適當的時間點將細胞進行混合培養及混合應用，從而達到增加各種免疫細胞的腫瘤殺傷活性的目的。
[0051]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明:免疫細胞培養基為美天旎公司生產的TexMACS免疫細胞培養基。
[0052]實施例1
[0053]1.采集120ml外周血，以240ml生理鹽水稀釋后利用Ficoll密度梯度離心法高效分離單個核細胞。
[0054]2.分離后將上層的血漿層轉移到一個500ml離心杯中，共獲得300ml稀釋血漿，在56°C水浴條件下滅活30min。滅活后在12000rpm的條件下離心lOmin，使用0.4um濾膜過濾上清后獲得近290ml自體血清，按照40ml/管分裝后備用。
[0055]3.配置細胞誘導培養基備用:
[0056]DC細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度8%的步驟2中制備的自體血清、150IU/ml 的 IL-4 和 1000IU/ml 的 GM-CSF;
[0057]CIK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有有體積濃度6%的步驟2中制備的自體血清和1000IU/ml的IL-2;
[0058]NK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度6%的步驟2中制備的自體血清、1000IU/ml的IL-2、200ng/ml的IL-12、100ng/ml的IL-15；
[0059]4.分離獲得的PBMC以40ml生理鹽水清洗一次后計數共獲得12.5*107個細胞，將細胞濃度調整至l*107/ml的濃度。按照8*107個細胞的數量、40ml美天旎免疫細胞培養基、4ml自體血清的體系在T-175細胞培養瓶中進行靜置培養。
[0060]5.1小時候后輕柔的取出培養體系中的上清液及未貼壁的細胞，加入40mlDC細胞誘導培養。
[0061 ] 6.上清液及未貼壁的細胞300-320g條件下離心5-8min離心后的沉淀細胞與未使用的分離細胞混合均勻后按照數量比1:1的比例平均加入到預包被1ug CD3McAb的T-175細胞培養瓶和預包被30ugCD16McAb的T-175細胞培養瓶中，在預包被1ug CD3McAb的T-175細胞培養瓶中加入10mlCIK細胞誘導培養基，并按照終濃度1000IU/ml加入IFN-r誘導CIK細胞。在預包被30ugCD16McAb的T-175細胞培養瓶中加入10mlNK細胞誘導培養基并按照終濃度1000IU/ml加入IFN-r誘導NK細胞。
[0062]7.培養第3天在CIK細胞培養體系中補加5ml自體血清、50000IU的IL-2繼續培養。
[0063]8.培養第4天在DC細胞培養體系中加入40mlDC細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養。同時在NK細胞培養體系中加入10mlNK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養。
[0064]9.第5天在CIK細胞培養體系中加入10mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0065]10.培養第6天在DC細胞培養體系中按照終濃度800IU/ml加入TNF-a混合均勻后繼續培養。
[0066]11.第7天(見圖1)將CIK細胞培養體系中的細胞懸液加入到1.8升容量的美天旎公司的細胞培養袋中并在培養體系中加入200mlCIK細胞誘導培養基、1ug的⑶3McAb和25ug的CD28McAb。與此同時將DC細胞培養體系中細胞全部(見圖2)收獲后加入到此體系中與CIK細胞共培養(DC-CIK共培養體系)；同時，將NK細胞培養體系中細胞懸液加入到另一個1.8升容量美天旎公司的細胞培養袋中并在培養體系中并加入300mlNK細胞誘導培養基及30ug的CD16McAb(NK細胞培養體系)。
[0067]12.第9天