在DC-CIK共培養體系中加入400mlCIK細胞誘導培養基。混合均勻后繼續培養。
[0068]13.第11天在DC-CIK共培養體系中加入800mlCIK細胞誘導培養基；與此同時在NK細胞培養體系中加入100mlNK細胞誘導培養基。
[0069]14 ?第14天取出100mlDC-CIK共培養體系中的細胞懸液，加入600mlCIK細胞誘導培養基；與此同時取出100mlNK細胞培養體系中的細胞懸液，加入600mlNK細胞誘導培養基。1000ml CIK細胞懸液中共含有2.5*109個細胞，其中CIK細胞的比例為26.8%; 1000mlNK細胞懸液中共含有2.3*19個細胞，其中NK細胞的比例為48.5 %。
[0070]15.第17天將所有的兩個細胞培養袋中的細胞收獲。1200ml CIK細胞懸液中共含有2.9*109個細胞，其中CIK細胞的比例為27.2%； 1200ml NK細胞懸液中共含有2.4*109個細胞，其中NK細胞的比例為55.3% (見圖3)。
[0071]實施例2
[0072]1.采集120ml臍帶血，以240ml生理鹽水稀釋后利用Ficoll密度梯度離心法高效分離單個核細胞。
[0073]2.分離后將上層的血漿層轉移到一個500ml離心杯中，共獲得310ml稀釋血漿，在56°C水浴條件下滅活30min。滅活后在12000rpm的條件下離心lOmin，使用0.4um濾膜過濾上清后獲得近298ml自體血清，按照40ml/管分裝后備用。
[0074]3.配置細胞誘導培養基備用:
[0075]DC細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度8%的步驟2中制備的自體血清、150IU/ml 的 IL-4 和 1000IU/ml 的 GM-CSF;
[0076]CIK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有有體積濃度6%的步驟2中制備的自體血清和1000IU/ml的IL-2;
[0077]NK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度6%的步驟2中制備的自體血清、1000IU/ml的IL-2、200ng/ml的IL-12、100ng/ml的IL-15；
[0078]4.分離獲得的PBMC以40ml生理鹽水清洗一次后計數共獲得11.2*107個細胞，將細胞濃度調整至l*107/ml的濃度。按照8*107個細胞的數量、40ml美天旎免疫細胞培養基、3ml自體血清的體系在T-175細胞培養瓶中進行靜置培養。
[0079]5.1小時候后輕柔的取出培養體系中的上清液及未貼壁的細胞，加入40mlDC細胞誘導培養。
[0080]6.上清液及未貼壁的細胞300-320g條件下離心5-8min離心后的沉淀細胞與未使用的分離細胞混合均勻后按照數量比1:1的比例平均加入到預包被1ug CD3McAb的T-175細胞培養瓶和預包被30ugCD16McAb的T-175細胞培養瓶中，在預包被1ug CD3McAb的T-175細胞培養瓶中加入100ml CIK細胞誘導培養基，并按照終濃度1000IU/ml加入IFN-r誘導CIK細胞。在預包被30ugCD16McAb的T-175細胞培養瓶中加入10mlNK細胞誘導培養基并按照終濃度1000IU/ml加入IFN-r誘導NK細胞。
[0081 ] 7.培養第3天在CIK細胞培養體系中補加5ml自體血清、50000IU的IL-2繼續培養。
[0082]8.培養第4天在DC細胞培養體系中加入40mlDC細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養。同時在NK細胞培養體系中加入10mlNK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養。
[0083]9.第5天在CIK細胞培養體系中加入10mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養；
[0084]10.培養第6天在DC細胞培養體系中按照終濃度800IU/ml加入TNF-a混合均勻后繼續培養。
[0085]11.第7天將CIK細胞培養體系中的細胞懸液加入到1.8升容量的美天旎公司的細胞培養袋中并在培養體系中加入200mlCIK細胞誘導培養基、1ug的CD3McAb和25ug的CD28McAb ο與此同時將DC細胞培養體系中細胞全部收獲后加入到此體系中與CIK細胞共培養(DC-CIK共培養體系)；同時，將NK細胞培養體系中細胞懸液加入到另一個1.8升容量美天旎公司的細胞培養袋中并在培養體系中并加入400mlNK細胞誘導培養基及30ug的⑶16McAb(NK細胞培養體系)。
[0086]12.第9天在DC-CIK共培養體系中加入400mlCIK細胞誘導培養基。混合均勻后繼續培養。
[0087]13.第11天在DC-CIK共培養體系中加入800mlCIK細胞誘導培養基；與此同時在NK細胞培養體系中加入100mlNK細胞誘導培養基。
[0088]14 ?第14天取出100mlDC-CIK共培養體系中的細胞懸液，加入600mlCIK細胞誘導培養基；與此同時取出100mlNK細胞培養體系中的細胞懸液，加入600mlNK細胞誘導培養基。1000ml CIK細胞懸液中共含有2.2*109個細胞，其中CIK細胞的比例為23.5%; 100mlNK細胞懸液中共含有2.0*19個細胞，其中NK細胞的比例為45.5 %。
[0089]15.第17天將所有的兩個細胞培養袋中的細胞收獲。1200ml CIK細胞懸液中共含有2.4*109個細胞，其中CIK細胞的比例為25.2%; 1200ml NK細胞懸液中共含有2.2*109個細胞，其中NK細胞的比例為48.8%。
[0090]實施例3
[0091]1.采集80ml外周血，以160ml生理鹽水稀釋后利用Ficoll密度梯度離心法高效分離單個核細胞。
[0092]2.分離后將上層的血漿層轉移到一個500ml離心杯中，共獲得220ml稀釋血漿，在56°C水浴條件下滅活30min。滅活后在12000rpm的條件下離心lOmin，使用0.4um濾膜過濾上清后獲得近210ml自體血清，按照40ml/管分裝后備用。
[0093]3.配置細胞誘導培養基備用:
[0094]DC細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度5%的步驟2中制備的自體血清、80IU/ml的IL-4和800IU/ml的GM-CSF；
[0095]CIK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有有體積濃度5%的步驟2中制備的自體血清和300IU/ml的IL-2 ；
[0096]NK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度5%的步驟2中制備的自體血清、300IU/ml的IL-2、20ng/ml的IL-12、50ng/ml的IL-15；
[0097]4.分離獲得的I3BMC以40ml生理鹽水清洗一次后計數共獲得8.5*107個細胞，將細胞濃度調整至l*107/ml的濃度。按照5*107個細胞的數量、40ml美天旎免疫細胞培養基、2ml自體血清的體系在T-175細胞培養瓶中進行靜置培養。
[0098]5.1小時候后輕柔的取出培養體系中的上清液及未貼壁的細胞，加入40mlDC細胞誘導培養。
[0099]6.上清液及未貼壁的細胞300-320g條件下離心5-8min離心后的沉淀細胞與未使用的分離細胞混合均勻后按照數量比1:1的比例平均加入到預包被4ug CD3McAb的T-175細胞培養瓶和預包被20ugCD16McAb的T-175細胞培養瓶中，在預包被4ug CD3McAb的T-175細胞培養瓶中加入10ml CIK細胞誘導培養基，并按照終濃度500IU/ml加入IFN-r誘導CIK細胞。在預包被20ugCD16McAb的T-175細胞培養瓶中加入10mlNK細胞誘導培養基并按照終濃度500IU/ml加入IFN-r誘導NK細胞。
[0100]7.培養第3天在CIK細胞培養體系中補加5ml自體血清、30000IU的IL-2繼續培養。
[0101]8.培養第4天在DC細胞培養體系中加入30mlDC細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養。同時在NK細胞培養體系中加入10mlNK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養。
[0102]9.第5天在CIK細胞培養體系中加入10mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續