培養；
[0103]10.培養第6天在DC細胞培養體系中按照終濃度500IU/ml加入TNF-a混合均勻后繼續培養。
[0104]11.第7天將CIK細胞培養體系中的細胞懸液加入到1.8升容量的美天旎公司的細胞培養袋中并在培養體系中加入200mlCIK細胞誘導培養基、4ug的CD3McAb和15ug的CD28McAb ο與此同時將DC細胞培養體系中細胞全部收獲后加入到此體系中與CIK細胞共培養(DC-CIK共培養體系)；同時，將NK細胞培養體系中細胞懸液加入到另一個1.8升容量美天旎公司的細胞培養袋中并在培養體系中并加入400mlNK細胞誘導培養基及20ug的⑶16McAb(NK細胞培養體系)。
[0105]12.第9天在DC-CIK共培養體系中加入400mlCIK細胞誘導培養基。混合均勻后繼續培養。
[0106]13.第11天在DC-CIK共培養體系中加入800mlCIK細胞誘導培養基；與此同時在NK細胞培養體系中加入100mlNK細胞誘導培養基。
[0107]14.第14天取出800mlDC-CIK共培養體系中的細胞懸液，加入400mlCIK細胞誘導培養基；與此同時取出800mlNK細胞培養體系中的細胞懸液，加入400mlNK細胞誘導培養基。800ml CIK細胞懸液中共含有1.7*109個細胞，其中CIK細胞的比例為25.4% ;800ml NK細胞懸液中共含有1.6*109個細胞，其中NK細胞的比例為48.2%。
[0108]15.第17天將所有的兩個細胞培養袋中的細胞收獲。1200ml CIK細胞懸液中共含有2.8*109個細胞，其中CIK細胞的比例為26.8%; 1200ml NK細胞懸液中共含有2.5*109個細胞，其中NK細胞的比例為51.2%。
[0109]綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的范圍之內。
【主權項】
1.一種同時制備抗腫瘤的聯合免疫細胞DC-CIK、NK的方法，其特征在于，以外周血或者臍帶血為原材料，通過Ficol I密度梯度離心法分離獲得PBMC和上層血漿，上層血漿采用滅活并凍融的方法獲得自體血清，自體血清配合免疫細胞培養基及多種細胞因子，將分離的PBMC分別誘導DC、CIK及NK，CIK細胞每隔2天擴大培養、NK細胞每隔3天擴大培養，最終保證能夠在14-17天同時達到數量要求，在CIK細胞誘導中，在第7天加入⑶28、CD3單抗提高CIK的擴增效率，在NK細胞擴增中，在第I天及第7天使用CD16單抗進行2次刺激的方法提高NK的擴增效率。2.根據權利要求1所述的同時制備抗腫瘤的聯合免疫細胞DC-CIK、NK的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)采集人體的外周血或者臍帶血，通過Ficoll密度梯度離心法分離獲得PBMC和上層血漿，上層血漿通過滅活、凍融、高速離心、過濾的流程從中制備出自體血清； 2)配置細胞誘導培養基備用 DC細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度5-10%的步驟I)中制備的自體血清、80-150IU/ml的IL-4和800-1500IU/ml的GM-CSF； CIK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有有體積濃度5-10%的步驟I)中制備的自體血清和 300-1000IU/ml 的 IL-2; NK細胞誘導培養基:免疫細胞培養基中含有體積濃度5-10%的步驟I)中制備的自體血清、300-1000IU/ml的IL-2、20_200ng/ml的IL-12、50_200ng/ml的IL-15； 3)分離獲得的PBMC取(5-10)*107個細胞接種至一個T-175細胞培養瓶中，加入40-50ml免疫細胞培養基、并加入步驟I)中制備的2_4ml的自體血清，孵育l-2h后將未貼壁的細胞吸出，貼壁的細胞中加入40-50ml DC細胞誘導培養基，誘導DC細胞； 4)將步驟3)中的未貼壁的細胞加入到未使用的I3BMC中，按照細胞數量比1:1的比例將所有細胞平均加入到分別提前4-12小時預包被4-10ug的⑶3McAb的T-175細胞培養瓶，以及預包被20-40ug的CD16McAb的T-175細胞培養瓶中；在預包被CD3McAb的培養瓶中加入10mlCIK細胞誘導培養基和終濃度500-1000IU/ml的IFN-r，誘導CIK細胞;在預包被CD16McAb的培養瓶中加入100ml NK細胞誘導培養基以及終濃度500-1000IU/ml的IFN-r，誘導NK細胞； 4)培養第3天，在CIK細胞誘導體系中補加5-10ml的自體血清、30000-100000IU的IL-2繼續培養； 5)培養第4天，在DC細胞誘導體系中加入30-40mlDC細胞誘導培養基，混合均勻后培養;同時NK細胞誘導體系中加入100ml NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養； 6)培養第5天，在CIK細胞誘導體系中加入10mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養； 7)培養第6天，在DC細胞誘導體系中按照終濃度500-1000IU/ml加入TNF-a，混合均勻后繼續培養； 8)第7天，將CIK細胞誘導體系中的全部細胞懸液加入到一個1.8升容量的細胞培養袋中并在培養體系中加入200ml CIK細胞誘導培養基并加入4-10ug的CD3McAb以及15-30ug的CD28McAb;與此同時將誘導DC細胞誘導體系中的細胞全部收獲后加入到上述細胞培養袋中與CIK細胞共培養；同時，將NK細胞誘導體系中的細胞懸液加入到另一個1.8升容量細胞培養袋中，并在培養體系中并加入400ml的NK細胞誘導培養基以及20-40ug的CD16McAb，混合均勻后繼續培養； 9)第9天，在DC+CIK細胞共培養的培養袋中加入400mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養； 10)第11天在DC+CIK細胞共培養的培養袋中加入800mlCIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時在NK細胞的培養袋中加入100ml的NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養； 11)第14天取出800-10001111的00+(:11(細胞共培養的培養袋中細胞懸液收獲細胞，并加入400-600ml的CIK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養;與此同時取出800-1000ml的NK細胞的培養袋中細胞懸液收獲細胞，加入400-600ml的NK細胞誘導培養基，混合均勻后繼續培養； 12)第17天，將DC+CIK細胞共培養的培養袋及NK細胞的培養袋中的所有細胞收獲。3.根據權利要求1或2所述的同時制備抗腫瘤的聯合免疫細胞DC-CIK、NK的方法，其特征在于，所述免疫細胞培養基為美天旎公司生產的TexMACS免疫細胞培養基。4.根據權利要求1或2所述的同時制備抗腫瘤的聯合免疫細胞DC-CIK、NK的方法，其特征在于，將獲得的血漿在56°C的條件下滅活30-35min后，通過-20°C完全凍結，在20-24°C融化后，通過10000-12000rpm的條件下離心5-10min，使用0.4um的濾膜過濾上清后獲得自體血清。5.—種如權利要求1-4任一項所述的同時制備方法制得的聯合免疫細胞。
【專利摘要】本發明公開了一種同時制備抗腫瘤的聯合免疫細胞DC-CIK、NK的方法及制得的聯合免疫細胞，利用Ficoll密度梯度離心法高效分離獲得單個核細胞，并利用細胞培養袋和免疫細胞誘導培養系統獲得足量的DC、CIK及NK細胞，最終將誘導的細胞聯合培養并應用于臨床治療以達到增強腫瘤殺傷效果的目的。本方法采用美天旎公司生產的TexMACS免疫細胞培養基和自體血清、多種細胞因子及聯合培養技術對DC、CIK及NK分別進行誘導培養并在一定時間點將細胞混合培養及應用，避免了胎牛血清的應用，減少外源致熱源、致敏源污染幾率，同時增強了最終混合細胞的腫瘤殺傷活性；利用細胞培養袋技術，減少細胞污染幾率，適合臨床治療應用。
【IPC分類】C12N5/0783, C12N5/0784, C12N5/0786
【公開號】CN105647865
【申請號】
【發明人】韓洪起, 魯振宇, 劉俊江, 張冰晶, 秦臻
【申請人】天津普瑞賽爾生物科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年4月7日