腫瘤原代細胞的培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及腫瘤原代細胞培養技術，具體地說，涉及一種新型高效的腫瘤原代細 胞培養方法。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是一類發病率和死亡率都非常高的疾病，嚴重危害著人類的生命和健 康，是導致殘疾和早死的主要疾病之一，在35~59歲年齡組中，惡性腫瘤居死因第一位。資 料顯示，2015年我國共有429.2萬新發腫瘤年病例和281.4萬癌癥死亡病例。腫瘤發病率以 3 %的速度遞增且呈年輕化趨勢，居各類疾病中死亡率之最。
[0003] 目前惡性腫瘤的治療包括手術，放療，化療，內分泌治療和生物免疫治療，
[0004] 其中以前三種為主，化療作為一種全身性的治療手段，因能廣泛的殺滅患者體內 的腫瘤細胞，提高患者的生存率和生存期，而在治療中占有非常重要的地位。隨著醫學的發 展，化療已經不再是單純起姑息性治療作用的手段，正在從姑息向根治過渡，1998年，世界 衛生組織提出，使用適當，化療在部分腫瘤(惡性滋養細胞腫瘤、急性淋巴細胞白血病、霍奇 金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、睪丸癌、急性粒細胞白血病、胚胎性橫紋肌肉瘤、小細胞肺癌和 卵巢癌等）中已成為可以治愈腫瘤的根治性治療手段。經輔助化療后可能治愈的腫瘤有乳 腺癌、成骨肉瘤、大腸癌、骨肉瘤、視網膜母細胞瘤、軟組織肉瘤及腎母細胞瘤等。化療在部 分晚期腫瘤中起姑息性治療作用，如延長患者生命、減輕癥狀和減少痛苦，如胃癌、食管癌、 非小細胞肺癌、頭頸部癌、腎癌、前列腺癌、冠心病等。雖然化療在腫瘤中占有非常重要的地 位，但化療常因伴有明顯的毒副反應和副作用，而且化療對于多數腫瘤，特別是實體瘤療 效仍不理想。其中，腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥是導致腫瘤化療失敗的常見因素，也是困 擾腫瘤治療的關鍵性難題。耐藥問題是極為普遍的臨床問題，據美國癌癥協會估計，90%以 上因腫瘤死亡的患者在不同程度上受到耐藥影響。腫瘤細胞耐藥分為原發性和獲得性耐藥 兩大類。目前臨床上通常的做法是，根據國際腫瘤臨床試驗的循證研究結果，得知不同的化 療藥物對不同腫瘤的治療敏感性不同，即每一種腫瘤有相應有效的化療藥物敏感譜，從而 選擇療效最高的化療單藥或多種藥物組成的聯合方案進行治療。但在臨床上經常碰到這樣 的情況，經循證研究公認為對某種腫瘤有效的治療方案，而對有的患者卻毫無效果。如阿霉 素對浸潤性乳腺癌是一種具有里程碑意義的治療藥物，但仍有50%的浸潤性乳腺癌病人對 這種藥不敏感。又如健擇，對非小細胞肺癌公認的療效明顯，但也有60%以上的病人療效并 不明顯。專家認為，這是因為腫瘤是一個異質性、多形態、分化程度不等的細胞群體。腫瘤對 各種化療藥物存在著明顯的個體差異。即不同的腫瘤類型或同一類型的不同病人，甚至同 一病人在不同的發病階段，對化療的敏感性并不完全相同，治療效果差別也很大。至今還沒 有一種化療藥物或幾種化療藥物的聯合應用，能對某一種腫瘤100%有效。為此，建立一種 像細菌敏感試驗一樣，通過相對可靠的敏感試驗方法，對不同的病人準確篩選敏感的化療 藥物，并確定其劑量，真正實現臨床的個體化用藥。
[0005] 目前常用的抗腫瘤化療藥物對患者治療的有效性低于70%，約20%_35%的患者 接受了不恰當的藥物治療。如果腫瘤治療能夠同病異治、因人而異、實施個體化治療，將能 夠大大提高療效，避免過度治療和降低患者經濟負擔，減少醫療資源的浪費。因此如何選擇 有效藥物，進行有的放矢的治療早已成為化療界所關注的問題。
[0006] 目前主要的藥敏檢測方法都是基于原代腫瘤細胞培養成功的基礎上。如ATP-生物 熒光體外腫瘤藥物敏感性檢測技術(ATP-TCA)、四唑鹽(MTT)比色法、細胞毒性差異染色法 (DiSC)等。但常規的原代腫瘤細胞脫離體內環境后，在體外最初培養的24小時后，大部分細 胞都會逐漸死亡飄浮，能夠貼壁生長的細胞占極少比例，傳統的原代腫瘤細胞培養，耗時較 長，樣品易污染，靈敏度較低等。這些缺點均會干擾實驗結果的準確性，進而影響到化療方 案的正確選擇和最終療效。一定程度上限制了藥敏試驗的推廣，使其陷入了迂回不前的局 面。原代單細胞培養將成為此類方法的瓶頸，制約著此類方法的成功率和可靠性。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是針對現有細胞培養技術中存在的不足，提供一種新型高效的腫瘤 原代細胞培養方法。
[0008] 為了實現本發明目的，本發明腫瘤原代細胞的培養方法，所述方法是在含0.1-1 OmM鈣離子或0.8-30V/V%血清(或血清替代品），并添加 Rho激酶(R0CK1和R0CK2)抑制劑的 標準培養基和飼養層細胞或細胞替代物中培養原代腫瘤細胞和/或飼養層細胞。
[0009] 所述Rho激酶抑制劑包括上游抑制劑和下游抑制劑，上游抑制劑包括TGF-b e ta、 EGFR、鈣粘素、G蛋白等中的至少一種；下游抑制劑包括肌球蛋白磷酸酶抑制劑、波形蛋白、 UMK、肌球蛋白輕鏈激酶、NHE、鈉/氫交換蛋白-1或肌球蛋白素等中的至少一種。培養基中 添加的Rho激酶抑制劑的終濃度為5-15μπι 〇 1/L。
[0010] 所述飼養層細胞包括來自哺乳動物(如:老鼠、狗、貓、牛、馬、豬等）的脾細胞、巨噬 胸腺細胞、纖維母細胞等。所述細胞替代物包括飼養層細胞提取物、條件培養基或甲醇固定 的小鼠胚胎成纖維細胞、纖連蛋白、膠原蛋白、吩噻嗪(vermitin)等中的至少一種;所述條 件培養基是指培養過飼養層細胞的培養液。
[0011 ]所述飼養層細胞可以是經過γ射線輻射或絲裂霉素 C處理后，抑制了其增殖性，但 仍保持代謝活性的飼養層細胞，其制備方法如下：
[0012] (1) γ射線輻射:取飼養層細胞，吸去培養液，PBS清洗2次，加入胰蛋白酶，于37°C 消化2~lOmin，細胞脫離皿底時，終止消化，制成單細胞懸液;將細胞懸液于1500r/min離心 3min，棄上清;加入2mL細胞培養液，用吸管吹打離散成高濃度細胞懸液;將細胞懸液轉移至 20mL無菌血清瓶中，進行γ射線（10-40Gy)照射20-36h;照射后的細胞懸液經離心后棄上 清，即得;或
[0013] ⑵絲裂霉素 c:取飼養層細胞，吸去培養液，加入H00μg/ml絲裂霉素 C，37 °C、5 % C02培養箱中培養l_5h后，用roS清洗2次，加入胰蛋白酶消化3~5min，終止消化;將細胞懸 液移入離心管，1500r/min離心5min，棄上清，向沉淀中加入細胞懸液重復離心1次，即得。
[0014] 所述飼養層細胞也可不必抑制其增殖性。在本發明的一個實施方案中，將飼養層 細胞放置在一個多孔過濾器上來阻止與原代腫瘤細胞的物理接觸。
[0015] 本發明涉及的標準培養基包括DMEM培養基、Ham's F-12培養基、Ham's F-10培養 基、RPMI 1640培養基、Eagle's Basal Medium(EBM)、Eagle，s Minimum Essential Medium (MEM)、HEPES、199培養基、MCDB131培養基、McCoy's5A培養基、MEF培養基、ES培養基、D-Hank's培養基，或它們中的兩種或兩種以上培養基組合。例如，DMEM和F12培養基等。
[0016]優選地，所述標準培養基中還添加有氨基酸、維生素、無機鹽、腺嘌呤、乙醇胺、葡 萄糖、肝素、皮質醇、胰島素、硫辛酸、酚紅、磷酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸鈉、三碘甲狀腺氨酸、 胸苷、轉鐵蛋白、檸檬酸鐵或硫酸亞鐵鹽等中的至少一種。
[0017]其中，所述氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨 酸或L-左旋谷氨酸等中的至少一種;所述維生素包括維生素 H、維生素 B6、維生素 B2、維生素 B1、維生素 B12、氯化膽堿、葉酸、肌醇或煙酰胺等中的至少一種;所述無機鹽包括硫酸銅、 硫酸鐵、氯化鉀、氯化鎂、鈉鹽以及微量元素硒、硅、鉬、釩、鎳、錫或鋅鹽等中的至少一種。
[0018] 在本發明的一個具體實施方案中，將實體瘤腫瘤病人術后分離的腫瘤組織在3小 時內在無菌環境進行單細胞分離處理，然后接種至預先包被好的裝有新鮮培養基的細胞培 養瓶中，在37 °C、5 % C02環境下培養2-14天，收集細胞。
[0019] 其中，所述新鮮培養基是含O.l-lOmM鈣離子或0.8-30V/V%血清，并添加 Rho激酶 抑制劑的標準培養基；
[0020] 細胞接種濃度為1 X 10°~1 X 106個/cm2,優選1 X 103~1 X 106個/cm2;
[0021] 細胞培養瓶的包被方法如下：將包被液加入培養瓶中，放置半小時以上，吸出溶 液，培養瓶在室溫下自然晾干，然后紫外照射過夜；
[0022] 所用包被液包括濃度為0.8 % -2.0 %的小牛血清、多聚賴氨酸