胞，吸去原培養液，用無血清1640洗兩遍，然后加10 %胰酶消化，待大部分細胞離壁變圓，用含10 %胎牛血清1640中和胰酶，收獲細胞，將培養物吸至尖底離心管，離心，1000轉/分，1min;
[0100]4、低滲:棄上清液，沿管壁緩緩加入預溫37°C的0.075M KCl溶液6?8ml，吹打混勻后置37°C溫箱30min;
[0101 ] 5、預固定:加I?1.5ml固定液(甲醇:乙酸=3:1)打勾離心2000rpm/min 1min ；
[0102]6、固定:離心后去上清加固定液6?8ml室溫30分鐘；
[0103]7、再固定:與步驟6—樣固定，時間為15分鐘或可延長，固定兩次
[0104]8、收集細胞待分析；
[0105]9、將細胞懸液打勻后滴片4?6張左右，平鋪于潔凈濾紙上，待干；
[0106]10、取2?3只容積為50ml的白瓷立式染缸，倒入pH6.5的EarIe ’ S溶液，加蓋后置水浴箱中加熱至87.5 °C;
[0107]11、將表面干燥的玻片標本放入預溫87.5°C的Earle ’ S溶液中溫育，片與片之間留有空隙，進行G顯帶；
[0108]12、標本溫育60min后，每隔5?1min取出I?2片，流水下沖洗。溫育時間約在60?120min之間；
[0? O9] 13、用新鮮配制的10 %Giemsa染色液染色8?1min，取出水洗，待干。
[0110]取第10代HA1221的100個中期分裂相細胞的染色體進行分析，圖5可見，細胞內染色體數目分布在50-55之間，而小鼠染色體數目2n = 40，從核型分析結果圖可見，該細胞為人源細胞。染色體條數增加主要是:第10號和X染色體;丟失的主要是:第I，3，5，7，8，9號。染色體結構畸變主要為I號染色體長臂3區2帶增加，11號染色體長臂2區2帶增加，12號染色體長臂2區4帶增加，18號染色體短臂I區I帶增加，19號染色體短臂I區3帶增加，22號染色體長臂I區I帶增加。分別計100個細胞的染色體條帶分析，二倍體染色體細胞占11%，二倍體和三倍體之間(包括三倍體)的細胞占89%，說明細胞染色體不穩定，屬亞三倍體，容易發生轉移。
[0111]細胞生長曲線繪制
[0112]分別取生長良好的對數生長期HAl221細胞(第20代)和A549細胞，胰蛋白酶消化細胞，輕輕吹勻，倍比稀釋，以每孔100uL(l.0 X 104/ml)J接種至96孔板，每孔再加入DMEM培養液10uL，使細胞終濃度為I X 13/孔，每組3個復孔，培養板放入孵箱。Oh后，在各組的3孔細胞中加入MTI20uL(5mg/mL)，置孵箱培養4h后取出，吸盡上清，加入DMSO 150uL，置孵箱30min后取出，混勻后吸盡孔內液體至一空白96孔板，微型振蕩儀上振蕩5min，選擇波長為590nm，在酶標儀上測定吸光值，取均值，DMSO做空白對照。其余細胞更換培養液。分別于12、24,48、72h測定吸光值，以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線，圖6可見HA1221生長速度明顯比A549高。
[0113]克隆形成實驗對其增殖能力進行檢測
[0114]分別取對數期生長的HA1221和A549細胞，消化、重懸，按每孔200個細胞，接種至6孔板中，每個細胞重復3孔，再放入37°C，5%C02細胞培養箱內培養，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時(約14天)，終止培養。用PBS小心浸洗2次，加1: 3醋酸/甲醇固定15分鐘。然后去固定液，加適量結晶紫染色30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，最后計算克隆形成率。克隆形成率=(克隆數/接種細胞數)X 100%。從圖7中可見，A549細胞克隆形成體積雖然較大，但克隆形成率明顯低于HA1221細胞。
[0115]體外成瘤能力檢測
[0116]消化對數生長期的細胞數，用生理鹽水洗2遍后制成細胞懸液，濃度為IX1MVmL。分別接種在3只免疫缺陷小鼠右側臀部皮下。圖8顯示接種44天腫瘤分別長成21mmX1 9mm、1 7mm X 18mm，20mmX 18mm。致瘤率 100%。
[0117]以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1.一種人肺腺癌細胞株HA1221，其特征在于，所述細胞株HA1221的保藏編號為CCTCCNo:C201618o2.權利要求1所述的人肺腺癌細胞株HA1221的建立方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)、去除中晚期肺癌病人胸腔積液中的血塊，離心后得到上清液和沉淀； (2)、將步驟(I)的沉淀用兩倍體積的PBS重懸，再按1:1的體積比緩慢貼壁加入到人外周血淋巴分離液的液面上； (3)、小心吸取分離液面交界處的液體，得到腫瘤細胞和部分上皮細胞、內皮細胞，無菌PBS清洗，離心棄上清； (4)、使用含0.5?2wt%的青-鏈雙抗的步驟(I)的上清液作為條件培養基培養步驟(3)的細胞； (5)、待細胞長滿時，用0.25?0.5wt %的胰酶消化，離心后，用I3BS將沉淀重懸成細胞懸液;所述PBS與沉淀的體積比為2?3:1; (6)、預先在干凈離心管中依次緩慢貼壁加入40%的比重為1.056的percoll液和20%的比重為1.031的口6代011液； (7)、將步驟(5)的細胞懸液緩慢貼壁加入到步驟(6)的離心管中，離心； (8)、吸取40%的percol I液面處的液體，無菌PBS清洗，離心棄上清，得到腫瘤細胞，使用步驟(4)中的條件培養基進行培養； (9)、重復步驟(4)-(8)—次，然后進行細胞傳代，傳代時，步驟(4)的條件培養基的上清液的比例每次減少20%，再相應增加20%含10%胎牛血清的DMEM培養基，到第五代時條件培養基為加青-鏈雙抗的10 %胎牛血清的DMEM培養基； (10)、將傳代五次后的細胞注射小鼠成瘤，殺小鼠取腫瘤并消化，得到原代人肺腺癌細胞株HA1221。3.根據權利要求2所述的人肺腺癌細胞株HA1221的建立方法，其特征在于，步驟(2)所述人外周血淋巴分離液的比重為1.077。4.根據權利要求2所述的人肺腺癌細胞株HA1221的建立方法，其特征在于，步驟(I)所述離心是在4 °C 1000rpm/min離心10111；[11;步驟(2)所述離心是在20°(^1350印111/111；[11升速5，降速0，水平離心25分鐘；步驟(7)所述離心是在20°C2000rpm/min，升速5，降速0，水平離心25分鐘。5.根據權利要求2所述的人肺腺癌細胞株HA1221的建立方法，其特征在于，步驟(4)的青-鏈雙抗的含量為Iwt %。6.根據權利要求2所述的人肺腺癌細胞株HA1221的建立方法，其特征在于，步驟(4)中置于37 °C、5 % 0)2的細胞培養箱中培養細胞。7.根據權利要求2所述的人肺腺癌細胞株HA1221的建立方法，其特征在于，步驟(5)中所述PBS與沉淀的體積比為2:1。
【專利摘要】本發明公開了一種人肺腺癌細胞株HA1221及其建立方法，所述人肺腺癌細胞株HA1221的保藏編號為CCTCC？No:C201618，其是將胸腔積液加入到人外周血淋巴分離液，得到腫瘤細胞和部分上皮細胞、內皮細胞，用胸腔積液加二抗培養基進行培養，雙密度梯度離心得到活力高的腫瘤細胞，反復貼壁剔除內皮及上皮細胞，逐步減少胸腔積液比例進行培養，至第5代時直接用含胎牛血清的培養基培養，培養細胞注射小鼠成瘤，殺小鼠取腫瘤并消化，得到活力好的原代腫瘤細胞。由于中晚期肺癌病人的組織標本一般難以獲得，成熟的高分化腫瘤細胞較難體外培養，本發明從比較容易獲得又不為病人帶來痛苦的胸腔積液中分離純化高分化的腫瘤細胞并成功建系，使得建立新的肺癌研究模型更簡單方便且成功率大大提高。CCTCC No:C20161820160128
【IPC分類】C12N5/09
【公開號】CN105647869
【申請號】
【發明人】何建行, 王雯珺, 列璞怡
【申請人】廣州醫科大學附屬第一醫院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月16日