再按PBS重懸液與人外周血淋巴分離液的體積比1:1，將PBS重懸液緩慢貼壁加入人外周血淋巴分離液的液面上，水平離心機20°C1350rpm/min(升速5，降速O)水平離心25分鐘；
[0047](3)、小心吸取分離液面交界處的約ImL液體(含腫瘤細胞和部分上皮細胞、內皮細胞)到新的離心管中，用無菌的I X PBS清洗三次，室溫，1000rpm/min，離心5分鐘，棄上清；
[0048](4)、步驟I離心得到的胸腔積液上清液，加入胸腔積液上清液含量Iwt %的青-鏈雙抗，作為條件培養基，置于37°C、5%⑶2的細胞培養箱(HERAcelll50i，USA)中培養步驟(3)的細胞，S卩(ImL液體，含腫瘤細胞和部分上皮細胞、內皮細胞)；
[0049](5)、待細胞長滿時，用0.3wt %的胰酶消化，離心后，用I3BS按2:1(PBS:沉淀)的體積比重懸成細胞懸液；
[0050](6)、預先在干凈離心管中緩慢貼壁加入40%的比重為1.056的percoll液和20%的比重為1.031的口6代011液；
[0051 ] (7)、將4ml步驟(5)的細胞懸液緩慢貼壁加入到步驟(6)已加入percoll液的離心管中，水平離心機20°C2000rpm/min(升速5，降速O)水平離心25min;
[0052](8)、吸取40 %的perco 11液面處的Iml液體(分離得到的活力高的腫瘤細胞)到新的離心管中，加入無菌PBS 2ml混勾1000rpm/min離心5min，重復洗滌I次，棄上清，得到腫瘤細胞，使用步驟(4)中的條件培養基進行培養；
[0053](9)、重復步驟(4)-(8)進行一次，然后進行細胞傳代，傳代時，步驟(4)的條件培養基的胸腔積液上清液的比例每次減少20%，再增加20%含10%胎牛血清的DMEM培養基，到第五代時條件培養基為加青-鏈雙抗的10%胎牛血清的DMEM培養基;傳代時，利用上皮和內皮細胞容易脫落，而腫瘤細胞貼壁更牢固的特點，丟棄先被胰酶消化脫落的細胞，剩下腫瘤細胞進行培養，逐步剔除內皮和上皮細胞；
[0054](10)、將傳代五次后腫瘤的細胞用胰酶消化，用生理鹽水洗2遍后制成細胞懸液，濃度為I X 17個/mL，將細胞懸液接種在免疫缺陷小鼠兩側皮下成瘤，待腫瘤形成，殺小鼠，取腫瘤組織塊，進行鼠間傳代。
[0055]通過10-70um尼龍細胞濾網去除細胞團以及細胞碎片，然后再用0.25%的胰蛋白酶消化約I小時，棄掉上清再次低速離心，得到了大量的腫瘤上皮樣細胞。
[0056]a 剪切
[0057]把已成瘤的腫瘤組織塊剪碎，約I?2mm3大小的組織塊。
[0058]b加液漂洗
[0059]將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂PBS洗2?3次(采用傾斜，自然沉降法)。
[0060](:消化
[0061 ] 使用含I %膠原酶II的完全細胞培養基(10%FCS的DMEM)37°C消化4小時，800r/min低速離心8分鐘后，棄掉上清。消化液的量應該是組織的8?10倍，消化過程中要間斷的振蕩搖勻，觀察組織呈絮狀，消化液變渾濁時即終止消化。
[0062]d 漂洗
[0063]將含有10%胎牛血清的DMEM(GIBCO)培養基沿瓶壁緩緩加入，終止漂洗2-3次后，加入DMEM(GIBCO)培養基重懸。
[0064]e機械分散
[0065]采用吸管吹打，通過10-70um尼龍細胞濾網去除細胞團以及細胞碎片，然后再用
0.25%的胰蛋白酶消化約I小時，棄掉上清再次低速離心，得到了大量的腫瘤上皮樣細胞，用10%胎牛血清的DMEM培養基進行體外培養，得到人肺腺癌細胞株HA1221，已在中國典型培養物保藏中心(中國，武漢，武漢大學)保藏，保藏日期為2016年I月28日，保藏編號為CCTCC No:C201618o
[0066]體外培養的細胞的鑒定
[0067]細胞形態及光鏡下觀察
[0068]細胞體外培養物呈貼壁狀態;不規則形，體積較大;各代細胞始終保持旺盛代謝；細胞形態穩定，即使傳至第50代，細胞形態和生長速度不變。凍存后復蘇良好。
[0069]在光鏡下觀察細胞生長情況如圖1所示:體外培養的單層貼壁細胞大小不一，形態不規則，多為梭形，少量為多角形，細胞體積大。
[0070]透射電鏡觀察細胞內部結構
[0071 ]透射電鏡樣品制作步驟
[0072 ] 1、取材:用于透射的細胞團塊小于Imm3。
[0073]2、固定:2.5%戊二醛，磷酸緩沖液配制固定2小時以上；用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分鐘，共3次;I %鋨酸固定液固定2?3小時；用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分鐘，共3次；
[0074]3、脫水:50%乙醇15?20分鐘；70%乙醇15?20分鐘；90%乙醇15?20分鐘；90%乙醇90%丙酮(1:1)15?20分鐘；90%丙酮15?20分鐘；以上在4°C冰箱內進行。100%丙酮室溫15?20分鐘，重復三次。
[0075]4、包埋:純丙酮+包埋液(2:1)室溫3?4小時;純丙酮+包埋液(1:2)室溫過夜;純包埋液37 °C 2?3小時；
[0076]5、固化:37 °C烘箱內過夜;45 V烘箱內12小時;60 V烘箱內24小時
[0077]6、切片:Leica EM UC 7型超薄切片機切片50?60nm;
[0078]7、雙染:3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色；
[0079]8,HITACHI H-7650透射電鏡觀察，拍片。
[0080]結果如圖2-1和2-2所示，從圖2可以看出:胞核巨大、畸形，多種形狀，有的核膜內陷呈鋸齒狀;有的見胞核內包裹一部分胞漿。核仁明顯，有的細胞含有多個核仁，核仁中間有空白區。胞漿內線粒體明顯增多，形狀不一，體積增大，峭增多。胞漿內內漿網較多，有部分明顯擴張、表面微絨毛較少。有的細胞見有新腔形成的趨勢，腔內有突入的微絨毛。
[0081 ]掃描電鏡觀察細胞表面結構
[0082]掃描電鏡樣品制作步驟
[0083]1、取材:對數生長期細胞消化后計數，5X 13個細胞(10ul)接種于蓋玻片上(面積為I cm2)，加適量DMEM培養液，放于孵箱，至細胞到生長對數期停止培養。
[0084]2、清洗:用PBS沖洗兩次。
[0085]3、固定:①2.5%戊二醛4°C預固定2小時;②0.1M磷酸緩沖液沖洗3次，每次各15分鐘;③I %鋨酸4°C后固定2小時。
[0086]4、清洗:0.1M磷酸緩沖液沖洗3次，每次各15分鐘。
[0087]5、脫水及置換:各15分鐘。50%乙醇—70%乙醇—90%乙醇—100%乙醇1、I1、III— 100%乙醇+醋酸正戊酯(2:1)^100%乙醇+醋酸正戊酯(1:2)^100%醋酸正戊酯1、11、III
[0088]6、臨界點干燥:樣品裝入樣品盒中入HCP-2臨界點干燥儀中干燥約2小時。
[0089]7、樣品粘貼:取雙面膠將已干燥的樣品粘貼于樣品臺上。
[0090]8、噴鍍:樣品入IB—3型離子濺射儀中噴金3分鐘。
[0091]9、掃描電鏡觀察:日立S-3000N。
[0092]結果如圖3所示，從圖3可以看出:細胞大小不一，細胞外形多為扁平，少數圓形(圖3-1)，表面許多長短不一的指狀微絨毛均勻分布，有大量絲狀偽足，還可以見到大小不一的泡狀凸起以及片層狀凸起的皺褶(圖3-2)。掃描電鏡未見有支原體等異常顆粒存在。
[0093]流式細胞儀檢測細胞周期
[0094]消化對數生長期的細胞，制成細胞懸液，PBS洗三遍，離心，用預冷的70%乙醇4°C固定過夜，用PBS洗一次后用PBS重懸，加PI 4°C避光孵育半小時，用流式細胞儀(BDFACScanto L)檢測。從圖4中通過Gl，G2/M期的比較，可見HA1221比A549細胞增殖速度更快。
[0095]染色體核型分析
[0096]細胞G顯帶核型分析操作步驟
[0097]1、細胞培養(16?24)11;
[0098]2、阻留中期分裂相在培養細胞中加入秋水仙酰胺，終濃度為0.05mg/ml搖勻后置37 0C溫箱，0.5h后加增強劑100微升(原液:蒸餾水= 1:99);
[0099]3、再過0.5h消化細