Reagent。（推薦以排槍或連續式加樣器及數字式加樣器加試劑，以保證加樣方便準確。）
[0121 ] 3、在37°C，5 % C02環境下孵育1-4小時。490nm讀取吸光度值。如果無法立即進行檢 測，則向每孔中加入25μ1 10%SDS終止反應，避光保存于室溫的濕盒中，最多可保存18小 時。
[0122] 4、數據分析
[0123] 測量后，所有數據傳輸到計算機使用相關的軟件統計算出該藥物的IC5Q和IC9Q，結 果如圖3所不。
[0124] (五)腫瘤對化療藥物敏感性的評價標準：
[0125] 高度敏感：IC5q〈25%PPC及IC9Q〈100%PPC
[0126] 中度敏感：IC5q〈25%PPC及IC9q>100%PPC
[0127] 輕度敏感：IC5〇>25%PPC及IC9〇〈100%PPC
[0128] 耐藥：IC5q>25%PPC及IC9q>100%PPC
[0129] IC9〇 :抑制90 %腫瘤生長時的血漿峰值濃度
[0130] ICso :抑制50 %腫瘤生長時的血漿峰值濃度
[0131 ] PPC:-定臨床用藥劑量對應的血漿峰值濃度
[0132]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 腫瘤原代細胞的培養方法，其特征在于，所述方法是在含ο . 1-1 OmM鈣離子或Ο . 8-30v/v%血清，并添加 Rho激酶抑制劑的標準培養基和飼養層細胞或細胞替代物中培養原代 腫瘤細胞和/或飼養層細胞。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述Rho激酶抑制劑包括TGF-beta、EGFR、 鈣粘素、G蛋白、肌球蛋白磷酸酶抑制劑、波形蛋白、LIMK、肌球蛋白輕鏈激酶、NHE、鈉/氫交 換蛋白-1或肌球蛋白素中的至少一種;培養基中添加的Rho激酶抑制劑的終濃度為5-15μ mol/L 〇3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述飼養層細胞包括來自哺乳動物的 脾細胞、巨噬胸腺細胞、纖維母細胞;所述細胞替代物包括飼養層細胞提取物、條件培養基 或甲醇固定的小鼠胚胎成纖維細胞、纖連蛋白、膠原蛋白、吩噻嗪中的至少一種;所述條件 培養基是指培養過飼養層細胞的培養液。4. 根據權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述飼養層細胞是經過γ射線輻 射或絲裂霉素 C處理后，抑制了其增殖性，但仍保持代謝活性的飼養層細胞，其制備方法如 下： (1) γ射線輻射:取飼養層細胞，吸去培養液，PBS清洗2次，加入胰蛋白酶，于37 °C消化2 ~lOmin，細胞脫離皿底時，終止消化，制成單細胞懸液;將細胞懸液于1500r/min離心3min， 棄上清;加入2mL細胞培養液，用吸管吹打離散成高濃度細胞懸液;將細胞懸液轉移至20mL 無菌血清瓶中，進行γ射線（10-40Gy)照射20-36h;照射后的細胞懸液經離心后棄上清，即 得;或 (2) 絲裂霉素 C:取飼養層細胞，吸去培養液，加入l-100μg/ml絲裂霉素 C，37 °C、5 % C02培 養箱中培養l_5h后，用PBS清洗2次，加入胰蛋白酶消化3~5min，終止消化;將細胞懸液移入 離心管，1500r/min離心5min，棄上清，向沉淀中加入細胞懸液重復離心1次，即得。5. 根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述標準培養基包括DMEM培養 基、Ham's F-12培養基、Ham's F-10培養基、RPMI 1640培養基、Eagle's Basal Medium、 Eagle's Minimum Essential Medium、HEPES、199培養基、MCDB131 培養基、McCoy's 5A培養 基、MEF培養基、ES培養基、D-Hank's培養基，或它們中的兩種或兩種以上培養基組合。6. 根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述標準培養基中還添加有氨基 酸、維生素、無機鹽、腺嘌呤、乙醇胺、葡萄糖、肝素、皮質醇、胰島素、硫辛酸、酚紅、磷酸乙醇 胺、腐胺、丙酮酸鈉、三碘甲狀腺氨酸、胸苷、轉鐵蛋白、檸檬酸鐵或硫酸亞鐵鹽中的至少一 種； 其中，所述氨基酸包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天門冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸或 L-左旋谷氨酸中的至少一種； 所述維生素包括維生素 H、維生素 B6、維生素 B2、維生素 B1、維生素 B12、氯化膽堿、葉酸、 肌醇或煙酰胺中的至少一種； 所述無機鹽包括硫酸銅、硫酸鐵、氯化鉀、氯化鎂、鈉鹽、硒鹽、硅鹽、鉬鹽、釩鹽、鎳鹽、 錫鹽或鋅鹽中的至少一種。7. 根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，將實體瘤腫瘤病人術后分離的腫 瘤組織在1-10小時內在無菌環境進行單細胞分離處理，然后接種至預先包被好的裝有新鮮 培養基的細胞培養瓶中，在37°C、5%C0 2環境下培養2-14天，收集細胞； 其中，所述新鮮培養基是含ο . l-lOmMl1?離子或Ο .8-30v/v%血清，并添加 Rho激酶抑制 劑的標準培養基； 細胞接種濃度為1 X 10°~1 X 1〇6個/cm2,優選1 X 103~1 X 106個/cm2; 細胞培養瓶的包被方法如下：將包被液加入培養瓶中，放置半小時以上，吸出溶液，培 養瓶在室溫下自然晾干，然后紫外照射過夜； 所用包被液包括濃度為〇. 8% -2.0 %的小牛血清、多聚賴氨酸、纖連蛋白、明膠、刀豆蛋 白A、肝素和抗⑶3單抗中的至少一種。8. 根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，將實體瘤腫瘤病人術后分離的腫 瘤組織在1-10小時內在無菌環境進行單細胞分離處理，然后與飼養層細胞一起接種至裝有 新鮮培養基的細胞培養瓶中，在37°C、5%C0 2環境下培養2-14天； 其中，所述新鮮培養基是含〇 . l-lOmMl1?離子或0.8-30v/v%血清，并添加 Rho激酶抑制 劑的標準培養基； 腫瘤單細胞接種濃度為：1 X 10°~1 X 1〇6個/cm2,優選1 X 103~1 X 106個/cm2; 飼養層細胞接種量為：1 X 1〇4~1 X 1〇5個/cm2。9. 根據權利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，將實體瘤腫瘤病人術后分離的腫 瘤組織在1-10小時內在無菌環境進行單細胞分離處理，然后接種至裝有新鮮培養基的細胞 培養瓶中，并向培養瓶中加入細胞替代物，在37 °C、5 % C02環境下培養2-14天，收集細胞； 其中，所述新鮮培養基是含〇 . l-lOmMl1?離子或0.8-30v/v%血清，并添加 Rho激酶抑制 劑的標準培養基； 細胞接種濃度為1 X 10°~1 X 1〇6個/cm2,優選1 X 103~1 X 106個/cm2; 當細胞替代物為飼養層細胞提取物和/或條件培養基時，它與新鮮培養基的添加比例 為1:99-99:1; 當細胞替代物為甲醇固定的小鼠胚胎成纖維細胞時，其添加量為1 X 1〇4~1 X 1〇5個/ cm2 ； 當細胞替代物為纖連蛋白、膠原蛋白、吩噻嗪時，它們與培養基的添加比例為1:99-99: 1〇10. 根據權利要求7-9任一項所述的方法，其特征在于，單細胞分離時切取實體瘤腫瘤 細胞較多、未壞死液化的部分，剝離腫瘤樣品表面的結締組織、纖維和脂肪，用無菌剪刀將 樣品剪碎成1mm 3的碎塊，然后將轉移至含組織消化液的離心管中；將離心管傾斜置于37°C 孵育箱中孵育1.5-3小時，每隔15-30分鐘振搖一次，使其充分消化;消化結束后用10ml吸管 反復吹打消化混合液，使組織塊完全分散;加入RPMI 1640培養液，混勻后400g離心10分鐘， 棄上清;然后加入RPMI 1640培養液重懸沉淀，400g離心10分鐘，棄上清;加入培養基混勻制 得細胞懸液，并進行細胞計數。
【專利摘要】本發明提供了一種新型高效的腫瘤原代細胞培養方法，所述方法是在含0.1-10mM鈣離子或0.8-30v/v％血清，并添加Rho激酶抑制劑的標準培養基和飼養層細胞或細胞替代物中培養原代腫瘤細胞和/或飼養層細胞。本發明解決了原代腫瘤細胞在體外難以培養的問題，培養的腫瘤細胞可以用來篩選新型抗腫瘤藥物或檢測腫瘤細胞對不同抗腫瘤藥物的敏感性。藥敏檢測實驗可提高腫瘤患者用藥準確性，為臨床醫師確定個體化療方案和開展個體化治療提供科學依據。
【IPC分類】C12N5/09
【公開號】CN105647870
【申請號】
【發明人】喻德華, 劉佳蘇
【申請人】深圳市優圣康醫學檢驗所有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月22日