、纖連蛋白、明膠、刀 豆蛋白A、肝素和抗⑶3單抗等中的至少一種。
[0023] 在本發明的另一個具體實施方案中，將實體瘤腫瘤病人術后分離的腫瘤組織在1-10小時內在無菌環境進行單細胞分離處理，然后與飼養層細胞一起接種至裝有新鮮培養基 的細胞培養瓶中，在37 °C、5 % C02環境下培養2-14天；
[0024] 其中，所述新鮮培養基是含O.l-lOmM鈣離子或0.8-30v/v%血清，并添加 Rho激酶 抑制劑的標準培養基；
[0025] 腫瘤單細胞接種濃度為:1 X 10Q~1 X 106個/cm2，優選1 X 103~1 X 106個/cm2;
[0026] 飼養層細胞接種量為：1 X 104~1 X 105個/cm2。
[0027] 在本發明的又一個具體實施方案中，將實體瘤腫瘤病人術后分離的腫瘤組織在1-10小時內在無菌環境進行單細胞分離處理，然后接種至裝有新鮮培養基的細胞培養瓶中， 并向培養瓶中加入細胞替代物(飼養層細胞的替代物），在37°C、5%C0 2環境下培養2-14天， 收集細胞。
[0028] 其中，所述新鮮培養基是含0.1-lOmM鈣離子或0.8-30v/v%血清，并添加 Rho激酶 抑制劑的標準培養基；
[0029] 細胞接種濃度為1 X l〇Q~1 X 1〇6個/cm2,優選1 X 1〇3~1 X 1〇6個/cm2;
[0030] 當細胞替代物為飼養層細胞提取物和/或條件培養基時，它與新鮮培養基的添加 比例為 1:99-99:1;
[0031] 當細胞替代物為甲醇固定的小鼠胚胎成纖維細胞時，其添加量為1 X 104~1 X 105 個個/cm2;
[0032] 當細胞替代物為纖連蛋白、膠原蛋白、吩噻嗪時，它與新鮮培養基的添加比例為1: 99_99:1〇
[0033] 本發明的腫瘤單細胞分離時，切取實體瘤腫瘤細胞較多、未壞死液化的部分(樣品 應不小于1.0克），剝離腫瘤樣品表面的結締組織、纖維和脂肪，用無菌剪刀將樣品剪碎成 1mm 3的碎塊，然后將轉移至含組織消化液的離心管中；將離心管傾斜置于37°C孵育箱中孵 育1.5-3小時，每隔15-30分鐘振搖一次，使其充分消化;消化結束后用10ml吸管反復吹打消 化混合液，使組織塊完全分散;加入RPMI 1640培養液，混勻后400g離心10分鐘，棄上清;然 后加入RPMI 1640培養液重懸沉淀，400g離心10分鐘，棄上清;加入培養基混勻制得細胞懸 液，并進行細胞計數。
[0034] 采用本發明方法能夠快速分離得到大量原代腫瘤細胞，使原代腫瘤細胞可以在體 外大量，無限的傳代培養，為腫瘤藥敏試驗的展開提供的大量的細胞，為細胞模型的建立創 造了可能性。
[0035]本發明解決了原代腫瘤細胞在體外難以培養的問題，培養的腫瘤細胞可以用來篩 選新型抗腫瘤藥物或檢測腫瘤細胞對不同抗腫瘤藥物的敏感性。藥敏檢測實驗可提高腫瘤 患者用藥準確性，為臨床醫師確定個體化療方案和開展個體化治療提供科學依據。
[0036]本發明的細胞培養方法為ATP-生物熒光體外抗腫瘤藥物敏感性檢測技術及MTT 檢測技術提供了大量的腫瘤細胞，解決了傳統培養方法耗時長，樣品易污染，靈敏度較低等 問題，為臨床腫瘤單向用藥和聯合用藥的藥敏實驗開展提供了可能。
【附圖說明】
[0037]圖1為本發明實施例4中96孔板和384孔板排布圖。
[0038]圖2為本發明實施例4中ATP濃度與相對熒光發光值的標準曲線。
[0039]圖3為本發明實施例4中MTT法腫瘤藥敏實驗的IC5Q(A)和IC9Q(B)結果。
【具體實施方式】
[0040]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0041]實施例1原代腫瘤細胞的分離培養 [0042](一)腫瘤單細胞分離處理
[0043]將實體瘤腫瘤(乳腺癌)病人術后分離的腫瘤組織在最短時間內在無菌環境中進 行單細胞分離處理。
[0044] 1、為了獲得足夠數量的活腫瘤細胞，要切取腫瘤細胞較多、未壞死液化的部分，標 本應不小于1.0克。取出標本后應立即浸入裝有PBS或RPM11640培養液的無菌小瓶中，并在3 小時內送抵實驗室。標本置于標本浸泡液中浸泡15分鐘。
[0045] 2、除去標本浸泡液，剝離腫瘤標本表面的結締組織、纖維和脂肪，用無菌剪刀將標 本剪碎成1mm 3的碎塊;然后將其轉移至含組織消化液的離心管中；將離心管傾斜置于37°C 孵育箱中孵育1.5-3小時，每隔15-30分鐘振搖一次，使其充分消化。
[0046] 3、消化結束后用10ml吸管反復吹打消化混合液，使組織塊完全分散。
[0047] 4、洗滌細胞。加入35ml RPMI 1640培養液，混勻后400g離心10分鐘，棄上清。如有 大量紅細胞(>25 % )，第一次離心后，棄上清，加入預冷的10ml紅細胞裂解液，使細胞懸浮， 冰浴5-10分鐘后加入20ml RPMI 1640培養液，400g離心10分鐘，棄上清。對于紅細胞較多的 胸腹水標本，冰浴時間延長15-20分鐘，并輕搖兩次。然后加入35ml RPMI 1640培養液重懸 沉淀，400g離心10分鐘，棄上清。加入3-5ml培養基混勻制得細胞懸液。
[0048] 5、細胞計數。吸取一定量的細胞懸液，適當稀釋后臺盼藍染色計數。
[0049](二)原代腫瘤細胞的體外培養
[0050]經過單細胞分離處理后接種至預先包被好的裝有新鮮培養基的細胞培養瓶中，在 37°C、5%C02環境下培養2-14天，收集細胞。
[005? ]所述新鮮培養基是含lmMl1?離子(或10v/v%血清），并添加 Rho激酶抑制劑的標準 培養基DMHM。
[0052]所用Rho激酶抑制劑為TGF_beta，EGFR，鈣粘素，G蛋白，肌球蛋白磷酸酶靶蛋白，波 形蛋白，LMK，肌球蛋白輕鏈激酶，NHE，鈉/氫交換蛋白-1，肌球蛋白素中的一種。培養基中 添加的Rho激酶抑制劑的終濃度為1 Ομπιο 1 /L。
[0053] 細胞接種濃度為IX 105個/cm2〇
[0054] 細胞培養瓶的包被方法如下：將包被液加入培養瓶中，放置半小時以上，吸出溶 液，培養瓶在室溫下自然晾干，然后紫外照射過夜。
[0055] 所用包被液包括濃度為0.8 % -2.0 %的小牛血清、多聚賴氨酸、纖連蛋白、明膠、刀 豆蛋白A、肝素和抗⑶3單抗中的一種。
[0056] 實施例2原代腫瘤細胞的分離培養 [0057](一)腫瘤單細胞分離處理
[0058]實體瘤腫瘤來自胃癌病人，單細胞分離處理方法同實施例1。
[0059](二)原代腫瘤細胞的體外培養
[0060]經過單細胞分離處理后與飼養層細胞一起接種至裝有新鮮培養基的細胞培養瓶 中，在37 °C、5 % C02環境下培養，將所述新鮮培養基是含0.1 mM媽離子(或0.8v/v %血清），并 添加 Rho激酶抑制劑的標準培養基HEPES。
[0061 ]所述飼養層細胞是來自老鼠的脾細胞，經過γ射線輻射或絲裂霉素 C處理后，抑制 了其增殖性，但仍保持代謝活性。飼養層細胞的具體制備方法如下：
[0062] (1) γ射線輻射:取飼養層細胞，吸去培養液，PBS清洗2次，加入胰蛋白酶，于37°C 消化2~10min，細胞脫離皿底時，終止消化，制成單細胞懸液。將細胞懸液于1500r/min離心 3min，棄上清。加入2mL細胞培養液，用吸管吹打離散成高濃度細胞懸液。將細胞懸液轉移至 20mL無菌血清瓶中，密封，放入塑料袋以隔水，然后放進預熱至37°C的保溫泡沫塑料盒內， 用透明膠封好塑料盒，立即送輻射中心進行γ射線（10_40Gy)照射20-36h。照射后的細胞懸 液經離心后棄上清，即得。
[0063] (2)絲裂霉素 C:取飼養層細胞，吸去培養液，加入10μg/ml的絲裂霉素 C，37°C、5% C02培養箱中培養2h后，用PBS清洗2次，加入胰蛋白酶消化3~5min，終止消化;將細胞懸液 移入離心管，1500r/min離心5min，棄上清，向沉淀中加入細胞懸液重復離心1次，即得。 [0064] 腫瘤單細胞接種濃度為：1 X 103~1 X 106個/cm2;
[0065] 飼養層細胞接種量為:1 X 104-1 X 105個/cm2;
[0066] 另外，飼養層細胞也可不經過γ射線輻射或絲裂霉素 C處理，抑制其增殖性。將飼 養層細胞放置在一個多孔過濾器上，從而阻止與原代腫瘤細胞的物理接觸。
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