7] 實施例3原代腫瘤細胞的分離培養
[0068] (一)腫瘤單細胞分離處理
[0069] 實體瘤腫瘤來自非小細胞肺癌病人，單細胞分離處理方法同實施例1。
[0070] (二)原代腫瘤細胞的體外培養I
[0071] 經過單細胞分離處理后接種至裝有新鮮培養基的細胞培養瓶中，并向培養瓶中加 入飼養層細胞的替代物，在37 °C、5 % C02環境下培養2-14天，收集細胞。
[0072]所述新鮮培養基是含lOmMl1?離子(或30v/v%血清），并添加 Rho激酶抑制劑的標準 培養基D-Hank' s，其中所添加的Rho激酶抑制劑為TGF-beta、EGFR、鈣粘素、G蛋白、肌球蛋白 磷酸酶抑制劑、波形蛋白、LIMK、肌球蛋白輕鏈激酶、NHE、鈉/氫交換蛋白-1或肌球蛋白素等 中的至少一種，培養基中添加的Rho激酶抑制劑的終濃度為1 Ομπιο 1 /L。
[0073] 細胞接種濃度為IX 104個/cm2。
[0074]所述飼養層細胞的替代物是飼養層細胞提取物。所述飼養層細胞提取物與新鮮培 養基的添加比例為1:99-99:1。
[0075](三)原代腫瘤細胞的體外培養II
[0076]經過單細胞分離處理后接種至裝有新鮮培養基的細胞培養瓶中，并向培養瓶中加 入飼養層細胞的替代物，在37 °C、5 % C02環境下培養2-14天，收集細胞。
[0077]所述新鮮培養基是含lOmMl1?離子(或30v/v%血清），并添加 Rho激酶抑制劑的標準 培養基D-Hank' s，其中所添加的Rho激酶抑制劑為TGF-beta、EGFR、鈣粘素、G蛋白、肌球蛋白 磷酸酶抑制劑、波形蛋白、LIMK、肌球蛋白輕鏈激酶、NHE、鈉/氫交換蛋白-1或肌球蛋白素等 中的至少一種，培養基中添加的Rho激酶抑制劑的終濃度為1 Ομπιο 1 /L。
[0078] 細胞接種濃度為IX 105個/cm2。
[0079] 所述飼養層細胞的替代物是條件培養基。所述條件培養基的制備方法如下；取培 養過幾天飼養層細胞的選擇培養液，其與新鮮培養基的添加比例為1:99-99:1。
[0080] (四）原代腫瘤細胞的體外培養III
[0081] 經過單細胞分離處理后接種至裝有新鮮培養基的細胞培養瓶中，并向培養瓶中加 入飼養層細胞的替代物，在37 °C、5 % C02環境下培養2-14天，收集細胞。
[0082]所述新鮮培養基是含lOmMl1?離子(或30v/v%血清），并添加 Rho激酶抑制劑的標準 培養基D-Hank ' s，其中所添加的Rho激酶抑制劑為:TGF-beta、EGFR、鈣粘素、G蛋白、肌球蛋 白磷酸酶抑制劑、波形蛋白、LIMK、肌球蛋白輕鏈激酶、NHE、鈉/氫交換蛋白-1或肌球蛋白素 等中的至少一種，培養基中添加的Rho激酶抑制劑的終濃度為1 Ομπιο 1 /L。
[0083] 細胞接種濃度為IX 106個/cm2。
[0084] 所述飼養層細胞的替代物是甲醇固定的小鼠胚胎成纖維細胞。
[0085] 甲醇固定的小鼠胚胎成纖維細胞，甲醇固定的小鼠胚胎成纖維細胞，其添加量為1 X 104-1 X 105個/cm2。
[0086] 實施例4體外培養的原代腫瘤細胞的藥敏檢測實驗
[0087]以實施例1-3中體外培養獲得的大量增殖原代腫瘤細胞為實驗對象，進行藥敏檢 測。本實施例的細胞藥敏檢測既可在96孔板上進行，也可以在384孔板上進行。
[0088](一)待檢測化學藥物的準備
[0089]根據待測藥物的臨床使用劑量及其所對應的血漿峰值濃度（peak plasma concentration，PPC)，設定8個檢測濃度。每個濃度之間三倍稀釋。每個濃度作2個平行孔。 最高起始濃度高于PPC-倍，這樣保證檢測窗口足夠寬，同時拉開檢查濃度。同時設定陰性 對照組:無藥對照孔。表1列舉了化療藥物臨血漿峰值濃度。
[0090] 表1常規化療藥物
[0091]
[0093] 待檢測化學藥物的稀釋：
[0094] 1、將藥物粉末或藥物溶劑用DMS0或培養基配成如上儲存液濃度，并分裝儲存。 [0095] 2、實驗前室溫溶解藥物并且用DMS0或培養基50倍稀釋藥物。并用單道加樣器加入 96孔板的A排中（圖1)。
[0096] 3、從起始最高濃度開始做對倍的濃度稀釋，共6或8個檢測濃度。用多道加樣器向 B-G排加入20μ1培養基。用多道加樣器從A排中吸出10μ1加入B排中，依次類推。這樣從A行到 F行，藥物的濃度是三倍的梯度稀釋。
[0097](二)細胞的接種和給與藥物處理
[0098] 1、取生長狀態良好的腫瘤細胞在顯微鏡下觀察其細胞形態，用移液器吸走培養液 后用預熱的PBS洗一次。加入適量的0.25%的胰酶消化細胞。血清終止消化后轉移到無菌離 心管中離心，如果是懸浮培養的細胞，用移液器轉移到無菌的離心管中離心。
[0099] 2、用合適的培養基重懸細胞，根據根據細胞倍增時間和藥物處理時間決定細胞接 種量。一般細胞接種量為500-15000個/wel 1，接種體積384孔板40μ1，96孔板90μ1。
[0100] 3、由于水分的蒸發會導致藥物濃度的變化，因此細胞培養板周圍空加入無菌水， 以減少水分蒸發對實驗結果的影響。96孔板和384孔板排布圖見圖1。
[0101] 4、用多道加樣器向384孔板40μ1的細胞懸液中加入?ομL藥物。設立0.2%DMS0對 照。
[0102] 5、用多道加樣器向96孔板90μ1的細胞懸液中加入?ομL藥物。設立0.2%DMS0對照。
[0103] 6、兩種藥物聯合應用的藥敏檢查時藥物的儲存濃度加倍，單藥體積由原來的10μ1 減為5μ1。
[0104] (三)ATP-生物熒光法體外腫瘤藥敏實驗(ATP-TCA)
[0105] 采用ATP生物熒光抗癌藥物敏感性檢測試劑盒(北京金紫晶生物醫藥技術有限公 司)檢測焚光值。
[0106] 試劑盒組成如下： 組織消化酶X2瓶/凍干 ATP提取液XI瓶/25ml 96孔培養板x4塊 熒光酶-熒光素系統x2瓶/凍干
[0107] 培養基X]瓶/200ml ATP生成抑制劑XI瓶/10ml 紅細胞裂解液xl瓶/25ml 熒光酶工作液xl瓶/25ml ATP標準xl瓶/凍干 說明書1份
[0108] 1、ATP 的提取
[0109]配制熒光酶-熒光素系統工作液。將12ml熒光酶工作液加入到熒光酶-熒光素系統 中，充分溶解混合配成發光工作液，室溫避光放置10分鐘。用多道加樣器自A-G行順序將ATP 提取液加入96孔培養板，每孔加入50μ1，更換吸頭向Η行加入50μ1 ATP提取液。室溫靜置5分 鐘后振湯20-30秒，制備測定。
[0110] 2、熒光測定
[0111] 完成ΑΤΡ提取后，用多道加樣器自96孔培養板A-G行順序依次吸出50μ1上清液，更 換吸頭從Η行吸出50μ1上清液，對應加入到熒光測定板中。
[0112] 熒光測定板中每孔加入50μ1發光工作液，在微量振蕩器上振蕩10秒鐘，立刻用熒 光掃描儀測定。
[0113] 3、ΑΤΡ標準曲線繪制
[0114] ΑΤΡ凍干瓶內加入無菌去離子水2ml，充分溶解，溶液濃度為l(T6m〇l/L。
[0115] 系列稀釋（10 倍)ATP 溶液，ATP 含量依次為 10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10- Vol/UlO^mol/UKTHmol/L加入配好的發光工作液，每個濃度取50μ1，設3個平行孔即刻 進行測量。以每個梯度平均熒光值為縱坐標，ΑΤΡ含量對數值為橫坐標做標準曲線，計算相 關系數和變異系數，結果如圖2所示。
[0116] 曲線方程:Y = 6E+10x，R2 = 0.9997
[0117] (四)MTT法腫瘤藥敏實驗
[0118] 采用 Promega公司的MTT檢測試劑盒 6? AQueou s One SolutionCell Pro 1 iferation Assay(G3580)對藥物處理后的細胞板進行檢測。
[0119] 1、融化CellTiter961?AQueous One Solution Reagent。室溫靜止90分鐘或37°C 水浴 10分鐘，可完全溶解20ml的CelITiter9:6?AQueous One Solution Reagent。
[0120] 2、在96孔板中，每孔 100μ1 培養基加20μ1 CellTiter96?AQueous One Solution