對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂，而最終利用細胞自身的修復機制造成剪切的DNA部位增加或者缺失DNA序列，進而達到敲除基因表達的目的。
[0031]而通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將其連接在一起得到SgRNA(single guide RNA, sgRNA)。最終再通過將表達sgRNA的序列與表達Cas9的序列相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，將其轉染細胞，便能夠對目的基因進行敲除。
[0032]作為本發明優選的實施例，本發明基因改造可以為:T細胞的TCR的α及β兩條鏈的恒定區域的相應編碼基因的外顯子用基因定點敲除技術(如CRISPR/Cas9技術)同時敲除，使T細胞的TCR不能夠具有活性。T細胞的TCR的α及β兩條鏈的恒定區域的相應編碼基因的外顯子用基因定點敲除技術尤其是CRISPR/Cas9技術同時敲除，其中包括采用基因定點敲除技術尤其是CRISPR/Cas9技術單獨敲除α的恒定區TRAC或者β的恒定區TCRBCl或者β的恒定區TCRBC2，或者組合敲除α的恒定區TRAC和β的恒定區TCRBCl，或者α的恒定區TRAC和β的恒定區TCRBC2，或者α的恒定區TRAC和β的恒定區TCRBCl以及TCRBC2。
[0033]本發明中，所述嵌合抗原受體(即第三代CAR)由scFv抗原結合序列、跨膜序列及胞內信號轉導序列組成。其中，scFv抗原結合序列包括針對不同腫瘤的序列，包括CD19(序列見 Seq-CD19_scFv)、CD30(序列見 Seq-CD30_scFv)、CD33(序列見 Seq-CD33_scFv)、CEA(序列見Seq-CEA-scFv)、cMet(序列見Seq-cMet-scFv)、EGFRvI II (序列見Seq-EGFRv II1-scFv)、FAP (序列見 Seq-FAP-scFv)、Her 2(序列見Seq-Her 2-scFv)、GD2(序列見Seq_GD2_scFv)、PSMA(序列見Seq-PSMA-scFv)、]^801:1161;[11(序列見369-]\16 801:1161;[11-80卩￥)和從^]\1(序列見Seq-NCAM-scFv)等中的一種。所述scFv抗原結合序列和跨膜序列之間包含一段鉸鏈序列(Hinge序列)。所述Hinge序列為⑶8的胞外鉸鏈結構。優選地，所述跨膜序列為⑶8。而經過實驗驗證簡化了操作，采用CD8分子的胞外鉸鏈結構將跨膜序列與scFv抗原結合序列直接相連接。換句話說，本發明跨膜序列包括CD8的鉸鏈序列及跨膜序列(序列見Seq-CD8_hinge-trans)。所述胞內信號轉導序列包括⑶28胞內結構域序列、4-1BB胞內結構域序列和CD3G胞內結構域序列等。其中，CD28胞內結構域序列見Seq-CD28-endo，4-lBB胞內結構域序列見Seq-4-lBB-endo，0)3ζ胞內結構域序列見Seq-Q)3G-endo。將這些不同的scFv抗原結合序列和CD8鉸鏈序列及跨膜序列、D28胞內結構域序列、4-1BB胞內結構域序列和CD3G胞內結構域序列組合，就可以得到針對不同血液腫瘤比如急性淋巴癌以及實體腫瘤，比如胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、胰腺癌等的嵌合抗原受體。
[0034]進一步地，本發明所述scFv抗原結合序列包括輕鏈可變區序列和重鏈可變區序列。優選地，本發明所述scFv抗原結合序列包括輕鏈可變區序列、重鏈可變區序列、連接輕鏈可變區序列和重鏈可變區序列的優化聯結區序列及位于輕鏈可變區序列之前的可溶信號肽序列。
[0035]本發明利用基因定點敲除技術，尤其是CRISPR/Cas9技術，改造T細胞，針對T細胞的TCR的α及β鏈的恒定區域進行基因敲除，使T細胞的TCR失活，從而使T細胞能夠進行異體移植而不會產生免疫排斥。再將這種失活TCR的T細胞結合CAR技術，能夠達到采用異體來源的T細胞靶向治療特定的腫瘤的目的。本發明解決了目前CART細胞技術只能夠通過分離自身的T細胞，然后結合CAR技術來治療腫瘤的不足，比如自身T細胞數量少、活性低、培養時間長的弊端。本發明能夠事先就采用健康人的血液分離高質量、高活性的T細胞進行改造，準備好針對各種腫瘤的CART細胞，腫瘤患者一旦需要CART治療就無需等待時間，最大限度地縮短治療等待的寶貴時間。
[0036]基于上述嵌合抗原受體T細胞，本發明還提供一種如上任一所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其包括步驟:
一種如權利要求1-9任一所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，包括步驟:
Α、在TCR的α和β鏈中的一種或兩種鏈的恒定區域的相應編碼基因的外顯子用基因定點敲除技術，使T細胞的TCR不具有活性，進而得到能夠進行異體移植的T細胞；
B、將攜帶嵌合抗原受體的慢病毒感染上述得到的能夠進行異體移植的T細胞，感染完成后得到可異體移植的嵌合抗原受體T細胞。
[0037]本發明主要包括以下幾個部分，一個是異體來源的T細胞，而這種T細胞經過基因定點敲除技術尤其是CRISPR/Cas9技術改造，將T細胞受體的兩條鏈即α及β兩條鏈分別或者同時敲除，從而使TCR失活，進而可以使這種T細胞異體移植而不會產生免疫排斥。二是將這種異體移植不會產生免疫排斥的T細胞結合第三代CAR技術制備成一種可以異體移植的通用型的CART，以便于腫瘤治療。
[0038]下面通過實施例對本發明進行詳細說明。
[0039]實施例1
異體移植TRAC失活的T細胞結合第三代CAR治療腫瘤
本實施例中，采用CRISPR/Cas9技術來敲除TCR的α鏈的恒定區編碼基因TRAC。針對TRAC的外顯子，包括外顯子1、外顯子2、外顯子3以及外顯子4，利用CRISPR/Cas9技術來敲除TRAC的外顯子I。根據TRAC外顯子序列，尤其是外顯子I的序列，設計表達sgRNA(single guideRNA，sgRNA)的序列包括有:Seq-TRAC-EXl-1、Seq-TRAC-EXl-2、Seq-TRAC-EXl-3、Seq-TRAC-EXl-4、Seq-TRAC-EXl-5。
[0040]進一步地，將上述序列，尤其是Seq-TRAC-EXl-1序列反向相互補，得到Seq-TRAC-EXl-1的反向互補序列(見序列Seq-TRAC-EXl-1-R)。
[0041 ] 進一步地，還需要在Seq-TRAC-EXl-1和Seq-TRAC-EXl-1-R兩端加上雙酶切位點BamH I和EcoR I，方便序列合成之后構建進入載體，加了雙酶切位點之后的序列分別見序列Seq-TRAC-EXl-1-BamH I和序列Seq-TRAC-EXl-l-R-EcoR I。
[0042]進一步地，將上述序列分別合成，序列合成之后，首先進行退火反應，其過程為:按照合成序列說明書將寡聚核苷酸單鏈用ddH20溶解成50 μΜ的溶液;然后將8μ1的Seq-TRAC-EXl-1-BamH Ι、8μ1 ^Seq-TRAC-EXl-1-R-EcoR I以及2μ1 的NEB Buffer 2和2 μ?的ddH20混合均勻，然后把EP管放在95°C水浴5分鐘。此后關閉水浴鍋，讓EP管在水浴鍋中自然降溫到常溫即完成退火，得到能夠表達sgRNA的雙鏈寡核苷酸。
[0043]然后將上述序列構建到CRISPR/Cas9載體上。構建過稱為:采用BamH I和EcoR I對CRISPR/Cas9載體進行雙酶切，然后用膠回收試劑盒進行膠回收。將膠回收的CRISPR/Cas9載體與合成并退火的能夠表達sgRNA的雙鏈寡核苷酸按照摩爾比例為1:10混合(20微升體系)，再加入T4 DNA連接酶buffer溶液，之后在45°C水浴熱激5分鐘，熱激之后放置到4°C冰箱5分鐘，最后加入2微升T4 DNA連接酶，在16攝氏度連接過夜。
[0044]之后將連接的質粒做細菌轉化，其過程為:將連接的質粒放置在冰上，并且將DH5a細菌(每管50微升)在冰上解凍;之后用微量移液器吸取3-5微升質粒，加入細菌中，混合均勻，然后將混合物繼續放置冰上5-10分鐘;然后將混合物在42 0C水浴熱激90秒鐘;然后迅速將混合物再放置在冰上冷卻2-3分鐘；最后加入500微升無菌LB培養基，放置在37 °C振蕩培養I小時;培養完成之后涂平板，然后放置在37°C培養過夜;第二天挑取克隆測序。
[0045]將測序正確的質粒轉染從健康人分離培養的T細胞進行TCR基因的敲除。轉染過稱為:將50微克構建好的質粒加入到100微升含有脂質體的混合溶液(50微升超純水和50微升脂質體混合)中，在室溫放置15分鐘。之后加入到I個10厘米培養皿培養的T細胞中，6個小時之后換上新鮮培養液。
[0046]質粒轉染完成之后，繼續培養T細胞并進一步擴增。由于TCR敲除的T細胞已經不會表達TCR，因此，TCR未被敲除的T細胞會表達，所以，采用熒光標記的抗TCRc^的抗體ant1-TCRc^-PE可以直接將質粒轉染后擴增的T細胞分為兩群細胞，一群是有熒光的T細胞，一群是沒有熒光的T細胞，而沒有熒光的T細胞即是目的細胞。因此，可以采用流式細胞術分離TCR敲除的細胞，其過程為:將質粒轉染并擴增之后的T細胞收集，并用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，之后加入ImL冰預冷的磷酸鹽緩沖液重懸細胞，再向其中加入20微升ant1-TCRc^-PE抗體，避光孵育30分鐘;孵育完成之后，用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，然后加入ImL磷酸鹽緩沖液過流式細胞儀，收集不帶熒光的細胞。細胞收集完成之后，繼續在體外擴增培養并凍存待用。
[0047]之后將針對不同類型腫瘤的攜帶CAR的慢病毒感染上述分離到的可以異體移植的T細胞，其過程為:在10厘米培養皿中培養TCR失活的T細胞(I X 17數量)，然后將包裝好的裝載CAR的慢病毒即PLVX-信號肽序列-scFv-CD8(鉸鏈及跨膜-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3ζ慢病毒ImL加入培養皿混合均勻，24小時之后換新鮮培養液即可。
[0048]病毒感染完成之后，就將表達CAR的TCR失活的T細胞大規模體外擴增。培養到足夠數量之后，對細胞進行收集，最后用磷酸鹽緩沖液清洗三遍之后，用于異體移植治療腫瘤。
[0049]實施例2
異體移植TCRBCl失活的T細胞結合第三代CAR治療腫瘤
在本實施例中，采用CRISPR/Cas9技術來敲除TCR的β鏈的恒定區編碼基因TCRBC1。針對TCRBCl的外顯子，包括外顯子1、外顯子2、外顯子3以及外顯子4，利用CRISPR/Cas9技術來敲除TCRBCl的外顯子I。根據TCRBCl外顯子序列，尤其是外顯