互補序列(見序列 Seq-TCRBCl-EXl-1-R)。
[0072]進一步地，還需要在Seq-TRAC-EXl-1和Seq-TRAC-EXl-1-R兩端加上雙酶切位點BamH I和EcoR I，方便序列合成之后構建進入載體，加了雙酶切位點之后的序列分別見序列Seq-TRAC-EXl-1-BamH I和序列Seq-TRAC-EXl-l-R-EcoR I。
[0073]進一步地，還需要在Seq-TCRBCl-ΕΠ-Ι和Seq-TCRBCl-En-1-R兩端加上雙酶切位點BamH I和EcoR I，方便序列合成之后構建進入載體，加了雙酶切位點之后的序列分別見序列Seq-TCRBCl-EXl-1-BamH I和序列Seq-TCRBCl-EXl-l-R-EcoR I。
[0074]進一步地，將上述序列分別合成，序列合成之后，首先進行退火反應，其過程為:按照合成序列說明書將寡聚核苷酸單鏈用ddH20溶解成50 μΜ的溶液;然后將8μ1的Seq-TRAC-EXl-1-BamH I或者Seq-TCRBCl-EXl-1-BamH Ι、8μ1 的Seq-TRAC-EXl-l-R-EcoR I或者Seq-TCRBCl-EXl-1-R-EcoR I 以及2μ1 的NEB Buffer 2和2 μ?的(IdH2O混合均勻，然后把EP管放在95°C水浴5分鐘。此后關閉水浴鍋，讓EP管在水浴鍋中自然降溫到常溫即完成退火，得到能夠表達sgRNA的雙鏈寡核苷酸。
[0075]然后將上述序列構建到CRISPR/Cas9載體上。構建過稱為:采用BamH I和EcoR I對CRISPR/Cas9載體進行雙酶切，然后用膠回收試劑盒進行膠回收。將膠回收的CRISPR/Cas9載體與合成并退火的能夠表達sgRNA的雙鏈寡核苷酸按照摩爾比例為1:10混合(20微升體系)，再加入T4 DNA連接酶緩沖溶液，之后在45 °C水浴熱激5分鐘，熱激之后放置到4°C冰箱5分鐘，最后加入2微升T4 DNA連接酶，在16攝氏度連接過夜。
[0076]之后將連接得到的質粒做細菌轉化，其過程為:將連接的質粒放置在冰上，并且將DH5a細菌(每管50微升)在冰上解凍;之后用微量移液器吸取3-5微升質粒，加入細菌中，混合均勻，然后將混合物繼續放置冰上5-10分鐘;然后將混合物在42°C水浴熱激90秒鐘;然后迅速將混合物再放置在冰上冷卻2-3分鐘；最后加入500微升無菌LB培養基，放置在37°C振蕩培養I小時;培養完成之后涂平板，然后放置在37 °C培養過夜;第二天挑取克隆測序。
[0077]將測序正確的質粒轉染從健康人分離培養的T細胞進行TCR基因的敲除。轉染過稱為:將50微克構建好的質粒加入到100微升含有脂質體的混合溶液(50微升超純水和50微升脂質體混合)中，在室溫放置15分鐘。之后加入到I個10厘米培養皿培養的T細胞中，6個小時之后換上新鮮培養液。
[0078]質粒轉染完成之后，繼續培養T細胞并進一步擴增。由于TCR敲除的T細胞已經不會表達TCR，因此，TCR未被敲除的T細胞會表達，所以，采用熒光標記的抗TCRc^的抗體ant1-TCRc^-PE可以直接將質粒轉染后擴增的T細胞分為兩群細胞，一群是有熒光的T細胞，一群是沒有熒光的T細胞，而沒有熒光的T細胞即是目的細胞。因此，可以采用流式細胞術分離TCR敲除的細胞，其過程為:將質粒轉染并擴增之后的T細胞收集，并用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，之后加入ImL冰預冷的磷酸鹽緩沖液重懸細胞，再向其中加入20微升ant1-TCRc^-PE抗體，避光孵育30分鐘;孵育完成之后，用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，然后加入ImL磷酸鹽緩沖液過流式細胞儀，收集不帶熒光的細胞。細胞收集完成之后，繼續在體外擴增培養并凍存待用。
[0079]之后將針對不同類型腫瘤的攜帶CAR的慢病毒感染上述分離到的可以異體移植的T細胞，其過程為:在10厘米培養皿中培養TCR失活的T細胞(I X 17數量)，然后將包裝好的裝載CAR的慢病毒即PLVX-信號肽序列-scFv-CD8(鉸鏈及跨膜-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3ζ慢病毒ImL加入培養皿混合均勻，24小時之后換新鮮培養液即可。
[0080]病毒感染完成之后，就將表達CAR的TCR失活的T細胞大規模體外擴增。培養到足夠數量之后，對細胞進行收集，最后用磷酸鹽緩沖液清洗三遍之后，用于異體移植治療腫瘤。[0081 ] 實施例5
異體移植TRAC及TCRBC2同時失活的T細胞結合第三代CAR治療腫瘤在本實施例中，采用CRISPR/Cas9技術來敲除TCR的α鏈的恒定區編碼基因TRAC以及β鏈的TCRBC2基因。針對TRAC及TCRBC2的外顯子，分別包括它們的外顯子1、外顯子2、外顯子3以及外顯子4，利用CRISPR/Cas9技術來敲除TRAC的外顯子I及TCRBC2的外顯子I。根據TRAC及TCRBC2的外顯子序列，尤其是外顯子I的序列，設計表達sgRNA(single guide RNA, sgRNA)的序列包括有:Seq-TRAC-EX 1-1、Seq-TRAC-EX I _2、Seq-TRAC-EX I _3、Seq-TRAC-EX I _4、Seq-TRAC-EXl-5，Seq-TCRBC2-EXl-l、Seq-TCRBC2-EXl-2、Seq-TCRBC2-EXl-3、Seq-TCRBC2_EXl-
4、Seq-TCRBC2-EXl_5。
[0082]進一步地，將上述序列，尤其是Seq-TRAC-EXl-1序列反向相互補，得到Seq-TRAC-EXl-1的反向互補序列(見序列Seq-TRAC-EXl-1-R)。
[0083]進一步地，將上述序列，尤其是Seq-TCRBC2_EX1-1序列反向相互補，得到Seq-TCRBC2-EX1-1 的反向互補序列(見序列 Seq-TCRBC2-EXl-l-R)。
[0084]進一步地，還需要在Seq-TRAC-EXl-1和Seq-TRAC-EXl-1-R兩端加上雙酶切位點BamH I和EcoR I，方便序列合成之后構建進入載體，加了雙酶切位點之后的序列分別見序列Seq-TRAC-EXl-1-BamH I和序列Seq-TRAC-EXl-l-R-EcoR I。
[0085]進一步地，還需要在Seq-TCRBC2-E)(l-1和Seq-TCRBC2-E)(l-1-R兩端加上雙酶切位點BamH I和EcoR I，方便序列合成之后構建進入載體，加了雙酶切位點之后的序列分別見序列Seq-TCRBC2-EXl-l-BamH I和序列Seq-TCRBC2-EXl_l-R-EcoR I。
[0086]進一步地，將上述序列分別合成，序列合成之后，首先進行退火反應，其過程為:按照合成序列說明書將寡聚核苷酸單鏈用ddH20溶解成50 μΜ的溶液;然后將8μ的Seq-TRAC-EXl-1-BamH I或者Seq-TCRBC2-EXl-l_BamH 1、8μ1 的Seq-TRAC-EXl-l-R-EcoR I或者Seq-TCRBC2-EXl-l-R-EcoR I 以及2μ1 的NEB Buffer 2和2 μ?的ddH20混合均勻，然后把EP管放在95°C水浴5分鐘。此后關閉水浴鍋，讓EP管在水浴鍋中自然降溫到常溫即完成退火，得到能夠表達sgRNA的雙鏈寡核苷酸。
[0087]然后將上述序列構建到CRISPR/Cas9載體上。構建過稱為:采用BamH I和EcoR I對CRISPR/Cas9載體進行雙酶切，然后用膠回收試劑盒進行膠回收。將膠回收的CRISPR/Cas9載體與合成并退火的能夠表達sgRNA的雙鏈寡核苷酸按照摩爾比例為1:10混合(20微升體系)，再加入T4 DNA連接酶buffer溶液，之后在45°C水浴熱激5分鐘，熱激之后放置到4°C冰箱5分鐘，最后加入2微升T4 DNA連接酶，在16攝氏度連接過夜。
[0088]之后將連接的質粒做細菌轉化，其過程為:將連接的質粒放置在冰上，并且將DH5a細菌(每管50微升)在冰上解凍;之后用微量移液器吸取3-5微升質粒，加入細菌中，混合均勻，然后將混合物繼續放置冰上5-10分鐘;然后將混合物在42 0C水浴熱激90秒鐘;然后迅速將混合物再放置在冰上冷卻2-3分鐘；最后加入500微升無菌LB培養基，放置在37 °C振蕩培養I小時;培養完成之后涂平板，然后放置在37°C培養過夜;第二天挑取克隆測序。
[0089]將測序正確的質粒轉染從健康人分離培養的T細胞進行TCR基因的敲除。轉染過稱為:將50微克構建好的質粒加入到100微升含有脂質體的混合溶液(50微升超純水和50微升脂質體混合)中，在室溫放置15分鐘。之后加入到I個10厘米培養皿培養的T細胞中，6個小時之后換上新鮮培養液。
[0090]質粒轉染完成之后，繼續培養T細胞并進一步擴增。由于TCR敲除的T細胞已經不會表達TCR，因此，TCR未被敲除的T細胞會表達，所以，采用熒光標記的抗TCRc^的抗體ant1-TCRc^-PE可以直接將質粒轉染后擴增的T細胞分為兩群細胞，一群是有熒光的T細胞，一群是沒有熒光的T細胞，而沒有熒光的T細胞即是目的細胞。因此，可以采用流式細胞術分離TCR敲除的細胞，其過程為:將質粒轉染并擴增之后的T細胞收集，并用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，之后加入ImL冰預冷的磷酸鹽緩沖液重懸細胞，再向其中加入20微升ant1-TCRc^-PE抗體，避光孵育30分鐘;孵育完成之后，用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，然后加入ImL磷酸鹽緩沖液過流式細胞儀，收集不帶熒光的細胞。細胞收集完成之后，繼續在體外擴增培養并凍存待用。
[0091]之后將針對不同類型腫瘤的攜帶CAR的慢病毒感染上述分離到的可以異體移植的T細胞，其過程為:在10厘米培養皿中培養TCR失活的T細胞(I X107數量)，然后將包裝好的裝載CAR的慢病毒即PLVX-信號肽序列-scFv-CD8(鉸鏈及跨膜-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3ζ慢病毒Iml加入培養皿混合均勻，24小時之后換新鮮培養液即可。
[0092]病毒感染完成之后，就將表達CAR的TCR失活的T細胞大規模體外擴增。培養到足夠數量之后，對細胞進行收集，最后用磷酸鹽緩沖液清洗三遍之后，用于異體移植治療腫瘤。
[0093]實施例6
異體移植TRAC及TCRBCl和TCRBC2同時失活的T細胞結合第三代CAR治療腫瘤在本實施例中，采用CRISPR/Cas9技術來敲除TCR的α鏈的恒定區編碼基因TRAC以及β鏈的TCRBCI和TCRBC2基因。針對TRAC及TCRBCI和TCRBC2的外顯子，分別包括它們的外顯子1、外顯子2、外顯子3以及外顯子4，