利用CRISPR/Cas9技術來敲除TRAC的外顯子I及TCRBCl和TCRBC2的外顯子I。根據TRAC及TCRBCl和TCRBC2的外顯子序列，尤其是外顯子I的序列，設計表達sgRNA(single guide RNA，sgRNA)的序列包括有:Seq-TRAC-EXl-l、Seq-TRAC-EXl_2、Seq-TRAC-EXl-3、Seq-TRAC-EXl-4、Seq-TRAC-EXl-5，Seq-TCRBCl-EXl-1、Seq-TCRBCl-EXl-2、Seq-TCRBQ-EX 卜3、Seq-TCRBCl-EXl-4、Seq-TCRBQ-EX 卜5，Seq-TCRBC2_EX1-1、Seq-TCRBC2-EX1-2、Seq_TCRBC2_EXl_3、Seq_TCRBC2_EXl_4、Seq_TCRBC2_EXl_5。
[0094]進一步地，將上述序列，尤其是Seq-TRAC-EXl-1序列反向相互補，得到Seq-TRAC-EXl-1的反向互補序列(見序列Seq-TRAC-EXl-1-R)。
[0095]進一步地，將上述序列，尤其是Seq-TCRBCl-EXl-1序列反向相互補，得到Seq-TCRBC1-EX1-1 的反向互補序列(見序列 Seq-TCRBCl-EXl-1-R)。
[0096]進一步地，將上述序列，尤其是Seq-TCRBC2_EX1-1序列反向相互補，得到Seq-TCRBC2-EX1-1 的反向互補序列(見序列 Seq-TCRBC2-EXl-l-R)。
[0097]進一步地，還需要在Seq-TRAC-EXl-1和Seq-TRAC-EXl-1-R兩端加上雙酶切位點BamH I和EcoR I，方便序列合成之后構建進入載體，加了雙酶切位點之后的序列分別見序列Seq-TRAC-EXl-1-BamH I和序列Seq-TRAC-EXl-l-R-EcoR I。
[0098]進一步地，還需要在Seq-TCRBCl-ΕΠ-Ι和Seq-TCRBCl-En-1-R兩端加上雙酶切位點BamH I和EcoR I，方便序列合成之后構建進入載體，加了雙酶切位點之后的序列分別見序列Seq-TCRBCl-EXl-1-BamH I和序列Seq-TCRBCl-EXl-l-R-EcoR I。
[0099]進一步地，還需要在Seq-TCRBC2-E)(l-1和Seq-TCRBC2-E)(l-1-R兩端加上雙酶切位點BamH I和EcoR I，方便序列合成之后構建進入載體，加了雙酶切位點之后的序列分別見序列Seq-TCRBC2-EXl-l_BamH I和序列Seq-TCRBC2-EXl_l-R-EcoR I。
[0100]進一步地，將上述序列分別合成，序列合成之后，首先進行退火反應，其過程為:按照合成序列說明書將寡聚核苷酸單鏈用ddH20溶解成50 μΜ的溶液;然后將8μ1的Seq-TRAC-EXl-1-BamH I或者Seq-TCRBCl-EXl-1-BamH I或者Seq-TCRBC2-EXl-l_BamH Ι、8μ1 的Seq-TRAC-EXl-1-R-EcoR I或者Seq-TCRBCl-EXl-l-R-EcoR I或者Seq-TCRBC2-EXl_l-R-EcoR I以及2μ1的NEB Buffer 2和2 μ?的ddH20混合均勻，然后把EP管放在95°C水浴5分鐘。此后關閉水浴鍋，讓EP管在水浴鍋中自然降溫到常溫即完成退火，得到能夠表達sgRNA的雙鏈寡核苷酸。
[0101]然后將上述序列構建到CRISPR/Cas9載體上。構建過稱為:采用BamH I和EcoR I對CRISPR/Cas9載體進行雙酶切，然后用膠回收試劑盒進行膠回收。將膠回收的CRISPR/Cas9載體與合成并退火的能夠表達sgRNA的雙鏈寡核苷酸按照摩爾比例為1:10混合(20微升體系)，再加入T4 DNA連接酶緩沖溶液，之后在45 °C水浴熱激5分鐘，熱激之后放置到4°C冰箱5分鐘，最后加入2微升T4 DNA連接酶，在16攝氏度連接過夜。
[0102]之后將連接得到的質粒做細菌轉化，其過程為:將連接得到的質粒放置在冰上，并且將DH5a細菌(每管50微升)在冰上解凍；之后用微量移液器吸取3-5微升質粒，加入細菌中，混合均勻，然后將混合物繼續放置冰上5-10分鐘；然后將混合物在42°C水浴熱激90秒鐘;然后迅速將混合物再放置在冰上冷卻2-3分鐘;最后加入500微升無菌LB培養基，放置在37°C振蕩培養I小時;培養完成之后涂平板，然后放置在37°C培養過夜;第二天挑取克隆測序。
[0103]將測序正確的質粒轉染從健康人分離培養的T細胞進行TCR基因的敲除。轉染過稱為:將50微克構建好的質粒加入到100微升含有脂質體的混合溶液(50微升超純水和50微升脂質體混合)中，在室溫放置15分鐘。之后加入到I個10厘米培養皿培養的T細胞中，6個小時之后換上新鮮培養液。
[0104]質粒轉染完成之后，繼續培養T細胞并進一步擴增。由于TCR敲除的T細胞已經不會表達TCR，因此，TCR未被敲除的T細胞會表達，所以，采用熒光標記的抗TCRc^的抗體ant1-TCRc^-PE可以直接將質粒轉染后擴增的T細胞分為兩群細胞，一群是有熒光的T細胞，一群是沒有熒光的T細胞，而沒有熒光的T細胞即是目的細胞。因此，可以采用流式細胞術分離TCR敲除的細胞，其過程為:將質粒轉染并擴增之后的T細胞收集，并用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，之后加入ImL冰預冷的磷酸鹽緩沖液重懸細胞，再向其中加入20微升ant1-TCRc^-PE抗體，避光孵育30分鐘;孵育完成之后，用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，然后加入ImL磷酸鹽緩沖液過流式細胞儀，收集不帶熒光的細胞。細胞收集完成之后，繼續在體外擴增培養并凍存待用。
[0105]之后將針對不同類型腫瘤的攜帶CAR的慢病毒感染上述分離到的可以異體移植的T細胞，其過程為:在10厘米培養皿中培養TCR失活的T細胞(I X 17數量)，然后將包裝好的裝載CAR的慢病毒即PLVX-信號肽序列-scFv-CD8(鉸鏈及跨膜-CD28-endo-4-lBB-endo-CD3ζ慢病毒ImL加入培養皿混合均勻，24小時之后換新鮮培養液即可。
[0106]病毒感染完成之后，就將表達CAR的TCR失活的T細胞大規模體外擴增。培養到足夠數量之后，對細胞進行收集，最后用磷酸鹽緩沖液清洗三遍之后，用于異體移植治療腫瘤。
[0107]綜上所述，本發明提供的一種可異體移植的嵌合抗原受體T細胞及其制備方法，本發明利用基因定點敲除技術，尤其是CRISPR/Cas9技術，改造T細胞，針對T細胞的TCR的α及β鏈的恒定區域進行基因敲除，使T細胞的TCR失活，從而使T細胞能夠進行異體移植而不會產生免疫排斥。再將這種失活TCR的T細胞結合CAR技術，能夠達到采用異體來源的T細胞靶向治療特定的腫瘤的目的。本發明解決了目前CART細胞技術只能夠通過分離自身的T細胞，然后結合CAR技術來治療腫瘤的不足，比如自身T細胞數量少、活性低、培養時間長的弊端。本發明能夠事先就采用健康人的血液分離高質量、高活性的T細胞進行改造，準備好針對各種腫瘤的CART細胞，腫瘤患者一旦需要CART治療就無需等待時間，最大限度地縮短治療等待的寶貴時間。
[0108]應當理解的是，本發明的應用不限于上述的舉例，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
【主權項】
1.一種可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，所述嵌合抗原受體T細胞包括T細胞和嵌合抗原受體，其特征在于，所述T細胞為經過基因工程改造的能夠進行異體移植的T細胞。2.根據權利要求1所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述T細胞為經過基因定點敲除技術在特定基因改造的T細胞。3.根據權利要求2所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述特定基因為TCR基因，所述TCR包括α鏈和β鏈，所述基因改造具體為:在TCR的α和β鏈中的一種或兩種鏈的恒定區域的相應編碼基因的外顯子用基因定點敲除技術，使T細胞的TCR不具有活性，進而使T細胞能夠進行異體移植。4.根據權利要求2所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述基因定點敲除技術為CRISPR/Cas9。5.根據權利要求1所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述嵌合抗原受體由scFv抗原結合序列、跨膜序列及胞內信號轉導序列組成。6.根據權利要求5所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述scFv抗原結合序列包括輕鏈可變區序列和重鏈可變區序列。7.根據權利要求5所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述scFv抗原結合序列為CD19、CD30、CD33、CEA、cMet、EGFRvII1、FAP、Her2、GD2、PSMA、Mesothelin和NCAM中的一種。8.根據權利要求5所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述跨膜序列為CD8。9.根據權利要求5所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述胞內信號轉導序列包括CD28胞內結構域序列、4-1BB胞內結構域序列和CD3G胞內結構域序列。10.—種如權利要求1-9任一所述的可異體移植的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，包括步驟: A、在TCR的α和β鏈中的一種或兩種鏈的恒定區域的相應編碼基因的外顯子用基因定點敲除技術，使T細胞的TCR不具有活性，進而得到能夠進行異體移植的T細胞； B、將攜帶嵌合抗原受體的慢病毒感染上述得到的能夠進行異體移植的T細胞，感染完成后得到可異體移植的嵌合抗原受體T細胞。
【專利摘要】本發明公開一種可異體移植的嵌合抗原受體T細胞及制備方法，本發明利用基因定點敲除技術，尤其是CRISPR/Cas9技術，改造T細胞，針對T細胞的TCR的α及β鏈的恒定區域進行基因敲除，使T細胞的TCR失活，從而使T細胞能夠進行異體移植而不會產生免疫排斥。再將這種失活TCR的T細胞結合CAR技術，能夠達到采用異體來源的T細胞靶向治療特定的腫瘤的目的。本發明解決了目前自身T細胞數量少、活性低、培養時間長的弊端。且能夠事先就采用健康人的血液分離高質量、高活性的T細胞進行改造，準備好針對各種腫瘤的CART細胞，腫瘤患者一旦需要CART治療就無需等待時間，最大限度地縮短治療等待的寶貴時間。
【IPC分類】C12N5/10
【公開號】CN105647871
【申請號】
【發明人】陳光風, 史秀娟, 劉小青
【申請人】蘇州佰通生物科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月27日