一種肝損傷靶向間充質干細胞及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種肝損傷靶向間充質干細胞及其制備方法 與應用。
【背景技術】
[0002] 肝臟是人體最大的消化器官，擔負著繁重而復雜的任務，除物質代謝外，還具有內 分泌和免疫調節等功能。肝臟所擔負的物質代謝功能也決定了它是最易遭受外界因素損傷 的器官之一，許多毒害物質的靶器官都是肝臟。各種原因如病毒、寄生蟲感染、乙醇、藥物或 化學毒害以及免疫功能紊亂等均能引起急、慢性肝損傷，長期或反復作用還可能導致肝硬 化甚至發展到肝衰竭、終末期肝病。肝病一旦發展到終末期，常規治療僅能緩解患者的臨床 癥狀，且療效不佳。肝移植被認為是治療終末期肝病的唯一有效手段，但由于供肝嚴重缺 乏、術后免疫抑制劑長期使用、圍手術期風險以及高額費用等問題，限制了肝移植的廣泛應 用，每年有大量的肝病患者因肝功能衰竭而死亡。
[0003] 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs)來源于發育早期的中胚層和外 胚層，屬于多能干細胞。MSCs最初在骨髓中發現，因其具有自我復制、多向分化潛能、造血支 持和促進干細胞植入、免疫調控、異體移植不易發生免疫排斥等特點而日益受到人們的關 注。如MSCs在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神 經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞。因其處于未分化狀態，增殖能力活躍，可以在體外大量 培養、擴增，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于 衰老和病變引起的組織器官損傷修復。國內外已有學者將不同來源的MSCs應用于肝病動物 模型、臨床前及臨床肝病的治療，取得了一些有意義的發現和可喜的治療效果。研究顯示， MSCs在體外可被誘導分化成具有肝細胞的形態、表型和功能特征的細胞，此類細胞能表達 白蛋白（albumin)、甲胎蛋白（alpha-fetal protein, AFP)、細胞角蛋白（cytokeratins， CK) CK8、CK18等肝系細胞和膽管細胞的特異性標志物;大鼠 MSCs移植到體內后能轉分化為 肝細胞樣細胞，表達肝細胞特異性標志物白蛋白；動物實驗和臨床研究結果顯示，自體骨髓 來源MSCs移植能夠顯著改善肝功能，減輕肝纖維化、肝腹水等癥狀。
[0004] 但MSCs移植治療肝病僅處于理論階段，在臨床應用中仍存在許多亟待解決的問 題。雖然大多數實驗表明MSCs對肝損傷有修復作用，但療效并不穩定，個體差異較大;更有 研究顯示MSCs移植對肝功能、組織結構的修復無作用，甚至有負面的影響。究其原因，一方 面，移植的MSCs只有定植/歸巢到病變部位，才能有效地發揮治療和修復作用，但體內研究 發現只有少量的移植細胞富集到了損傷或病變部位;其次，移植的MSCs定植到肝損傷部位， 有的分化為肝巨噬細胞（kupffer cell)，而肝巨噬細胞對于肝星形細胞（hepatic stellate cell)的活化、增殖、迀移、存活等有促進作用，不利于炎癥和纖維化的修復;有的 召集肌成纖維細胞(myofibroblast)而促進其分泌膠原產生纖維化;有的可以轉分化為功 能性的肝星形細胞和肌成纖維細胞，更多地分泌膠原等細胞外基質，從而進一步增強了肝 臟的纖維化損傷（參見：Zhao Q, Ren H, Zhu D, Han Z. Stem/progenitor cells in liver injury repair and regeneration. Biol Cell, 2009, 101(10): 557-571；Ji J, He BP, Dheen ST, Tay SS. Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration of mesenchymal stem cells to the impaired site in the brain after hypoglossal nerve injury. Stem Cells, 2004，22(3): 415-427)。因此， 提高MSCs在病變組織的定植能力，增加歸巢至損傷部位的細胞數量將有助于改善移植治 療效果，并且，改善MSCs移植治療肝損傷的效果，還需要減輕或避免其促炎、促纖維化等副 作用。從而很有必要對移植的MSCs種子細胞進行修飾和質量控制。
【發明內容】
[0005] 本發明目的是提供一種高效肝損傷靶向間充質干細胞及其制備方法，增加歸巢到 病灶部位的MSCs數量，提高間充質干細胞在病灶部位的定植能力；有助于提高MSCs對肝損 傷的靶向性，改善MSCs對肝功能和肝組織結構的治療和修復效果。
[0006] 本發明采用以下技術方案實現本發明目的： 一種肝損傷靶向間充質干細胞，由間充質干細胞轉染或感染核酸制備得到;所述核酸 為miR-26b。優選的所述肝損傷靶向間充質干細胞由間充質干細胞轉染或感染核酸后，再經 過堿性成纖維細胞生長因子處理得到。
[0007] 上述技術方案中，所述間充質干細胞來源于骨髓、脂肪組織、牙髓、臍帶、臍帶血、 羊水或者胎盤。本發明中的間充質干細胞來源廣泛，可以是自體的，也可以是異體的，來源 充足，細胞的增殖、存活、分化、迀移、合成與分泌因子等各方面能力優良，無倫理問題、免疫 原性低，應用前景廣闊。
[0008] 本發明還公開了上述肝損傷靶向間充質干細胞的制備方法，通過轉染試劑將miR-26b轉入間充質干細胞得到肝損傷靶向間充質干細胞;或者通過病毒載體將miR-26b轉入間 充質干細胞得到肝損傷靶向間充質干細胞。本發明使MSCs高表達miR-26b的方法，包括利用 各種轉染試劑，包括脂質體轉染試劑，如Lipofectamine 2000等，轉染miR-26b;也包括利用 臨床上證實安全有效的病毒，如腺相關病毒AAV、腺病毒Adenovirus、逆轉錄病毒、慢病毒 等，構建表達miR-26b前體的重組病毒，感染MSCs。轉染或感染24~48 h后，RT-qPCR檢測 miR-26b顯著高表達，得到肝損傷靶向的間充質干細胞。
[0009] 上述技術方案中，通過轉染試劑將miR_26b轉入間充質干細胞得到肝損傷靶向間 充質干細胞的步驟為將miR_26b模擬物與轉染試劑分別用L-DMEM稀釋后混合，室溫靜置得 到轉染混合液;然后將培養至第4~8代、匯合度達80%~90%的間充質干細胞經roS洗滌，再 加入轉染混合液和L-DMEM;然后于37°C培養箱中孵育5~6 h，接著將轉染混合液更換為完 全培養基，繼續培養36~48 h即可得到肝損傷革E1向間充質干細胞;通過病毒載體將miR-26b 轉入間充質干細胞得到肝損傷靶向間充質干細胞的步驟為將培養至第4~8代、匯合度達 80%~90%的間充質干細胞經PBS洗滌，然后加入表達miR-26b的病毒上清液，37°C感染90 min后，病毒上清液更換為完全培養基繼續培養24~48 h即可得到肝損傷靶向間充質干細 胞。比如將50 nM miR-26b mimic與5 μL Lipofectamine 2000以250 μL L-DMEM分別稀釋， 室溫靜置10 min后將二者合并，室溫靜置30 min。將培養至第4~8代、匯合度達80%~90%的 MSCs PBS洗2次，加入轉染混合液和500 μL L-DMEM，37°C培養箱中孵育6 h，更換為完全培 養基，繼續培養48 h即可。或者選擇培養至第4~8代、匯合度達80%~90%的MSCs，PBS洗2次， 加入表達miR-26b的病毒上清液，37°C感染90 min后，更換為完全培養基繼續培養24~48 h，RT_qPCR檢測miR_26b顯著高表達且細胞狀態良好，即可得到肝損傷靶向的間充質干細 胞。
[0010]上述技術方案中，通過轉染試劑將miR-26b轉入間充質干細胞，然后再經過堿性成 纖維細胞生長因子(bFGF)處理得到肝損傷靶向間充質干細胞;或者通過病毒載體將miR-26b轉