入間充質干細胞，然后再經過堿性成纖維細胞生長因子處理得到肝損傷靶向間充質 干細胞。比如將轉入miR-26b的間充質干細胞置入帶有堿性成纖維細胞生長因子的培養基 中，處理0.5~24 h得到肝損傷靶向間充質干細胞;所述帶有堿性成纖維細胞生長因子的培 養基中，堿性成纖維細胞生長因子的濃度為5~20 ng/mL;使用bFGF處理MSCs，可進一步提 高MSCs靶向肝損傷部位的效率，改善肝功能和組織結構恢復的效果。
[0011] MicroRNAs (miRNAs)是一種小的、類似于siRNA的核酸分子，由基因組編碼，在不 同的組織細胞類型中miRNAs分子的表達譜和表達量有很大差異，因此不同miRNA的功能不 同，即便是同一種miRNA在不同的組織細胞類型中所發揮的功能可能也有很大差異。不同修 飾狀態的間充質干細胞與體內細胞因子的親和力不同，使得趨化、定植數量不同，定植于肝 臟的間充質干細胞數量不同，分化、轉分化效率及旁分泌等作用強弱就不同，其發揮的生物 學效應也不同，對疾病的改善亦有所差異。
[0012] 本發明公開的肝損傷靶向間充質干細胞可以高效定植于肝損傷部位，避免血流沖 刷或者自然脫落，增加歸巢細胞量，并且低表達smad蛋白，避免移植MSCs存在的促纖維化風 險，從而不僅有效發揮間充質干細胞修復肝損傷部位的組織結構與功能的作用，更降低了 現有MSCs存在的促纖維化風險，真正實現移植間充質干細胞的肝損傷修復。因此本發明還 公開了上述肝損傷靶向間充質干細胞在制備治療肝損傷的靶向藥物中的應用；引起肝損傷 的途徑主要為病毒感染、寄生蟲感染、乙醇毒害、藥物毒害、化學毒害或者免疫功能紊亂等， 動物體內肝損傷主要表現為病灶部位細胞凋落、組織壞死等，對于肝損傷的修復主要是通 過各種方法穩定保護受損的肝細胞，促進病變細胞恢復，刺激正常肝細胞DNA合成，促進肝 細胞再生，減輕肝纖維化，以重建正常的肝組織結構，修復肝功能。間充質干細胞藥物一般 為注射型，通過血管輸入，隨著血液循環，到達病灶部位。與體外相比，動物體內的血液環境 復雜，存在各種物質與因子，而且不同部位的微環境差別大，對間充質干細胞的輸送有明顯 影響;并且肝損傷部位為活性組織，具有自身新陳代謝，還受血流、免疫系統的影響，不利于 外來細胞的定植和存活。這也是現有技術中，體外效果不錯(增殖、迀移能力強)的間充質干 細胞在體內肝損傷部位定植能力差、歸巢細胞數量少的主要原因。
[0013] 本發明公開的間充質干細胞能顯著提高歸巢于肝臟損傷部位的移植細胞數量，提 高細胞定植能力，為有效進行肝損傷修復提供良好的基礎;本發明公開的間充質干細胞可 以減輕肝纖維化程度，改善肝功能指標，提高免疫功能，降低炎性細胞因子分泌的能力，減 輕炎癥反應，抑制肝星狀細胞活化、阻止細胞外基質的生成，激活卵原細胞，促進肝細胞再 生;因此，基于本發明間充質干細胞的靶向藥物可以有效修復肝損傷。
[0014] 本發明中microRNA_26b (miR_26b)調節MSCs的定向富集，在MSCs中表達miR-26b，顯著促進了MSCs趨向肝損傷部位的能力；尤其是5~20 ng/mL(優選10 ng/ml)的bFGF 處理后顯著促進了表達miR-26b的MSCs趨向肝損傷部位的能力，修復損傷部位的組織結構 和功能;并且表達miR_26b的MSCs下調其表達smad蛋白，降低移植MSCs的促纖維化風險，從 而有利于肝損傷的修復。根據本發明的實施例，構建了表達miR-26b的重組腺病毒（Ad-26b)，MSCs感染Ad-26b 48 h后，移植到急、慢性肝損傷模型小鼠體內，移植前一天細胞用含 bFGF的培養基處理24 h，移植7 d、14 d后收集小鼠血液分析肝功能，處死小鼠取肝臟組織 做冷凍切片和石蠟切片，進行免疫熒光染色、HE染色或Masson染色，觀察移植細胞在肝組織 中的數量及分布，分析肝組織炎癥、纖維化等病理修復情況；結果顯示，高表達miR_26b的 MSCs移植對肝損傷具有良好的治療和修復效果，為臨床應用提供理論和實驗依據。
【附圖說明】
[0015] 圖1為實施例一制備的高表達miR-26b的人臍帶來源間充質干細胞的表達圖； 圖2為實施例一的高表達miR-26b的人臍帶來源間充質干細胞通過尾靜脈注射移植到 CC14誘導的急性肝損傷小鼠中7 d、14 d后肝臟冷凍切片圖； 圖3為實施例一間充質干細胞肝損傷部位的數量圖； 圖4為實施例二的高表達miR-26b的人臍帶來源間充質干細胞通過尾靜脈注射移植到 CC14誘導的慢性肝損傷小鼠中7 d、14 d后肝臟冷凍切片圖； 圖5為實施例二間充質干細胞肝損傷部位的數量圖； 圖6為實施例二的高表達miR-26b的人臍帶來源間充質干細胞通過尾靜脈注射移植到 CC14誘導的慢性肝損傷小鼠中7 d、14 d后肝臟石蠟切片Masson染色圖。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合附圖及實施例對本發明做進一步描述。
[0017] 實施例一高表達miR-26b的人臍帶來源間充質干細胞移植到急性肝損傷小鼠模 型 1.急性肝損傷實驗動物模型的準備 昆明種小鼠，40只，雄性。隨機數字表法分為正常對照組（10只）和模型組(50只）。模型 組均按照5 ml/kg劑量一次性皮下注射CC14與橄欖油等體積（1:1)混合液，正常對照組皮 下注射等劑量橄欖油。建模24 h后，進行移植實驗。
[0018] 2. MSCs的分離、培養及鑒定 采用人臍帶來源的間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells， HUCMSCs)。采集新生兒臍帶約10 cm，去除臍帶外膜層和臍帶內動靜脈，保留華爾通膠，機械 法消化，剪碎至約1 mmXl mmXl mm，平鋪接種于75 cm2培養瓶，10% FBS+L-DMEM，37°C，飽 和濕度下，5% C02培養箱培養，倒置相差顯微鏡下逐日觀察，3~5 d后半量換液，以后每3 d 用含10% FBS的L-DMEM全量換液，待細胞融合至50%后去除組織塊，繼續培養，待細胞融合至 80%~90%后傳代。取1~5代傳代細胞，制成單細胞懸液，以0.4%臺盼藍作為染色劑，用細胞計 數板計數活細胞和死細胞，共3次，取3次平均值，計算細胞活率:活細胞率(％)=(未染色細胞 數/觀察細胞總數）X 100%。活率在90%以上。
[0019] 不同生長周期的HUCMSCs其形態學有其不同特點，利用倒置相差顯微鏡和熒光顯 微鏡觀察細胞的生長情況及形態學特點。
[0020] 貼壁細胞常規0.25%胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的L-DMEM液終止，加入含1% FBS的roS液洗滌后，以FITC標記的⑶105 (SH2)、⑶44抗體及其相應同型對照標記細胞，流 式細胞儀檢測。
[0021]細胞表面⑶分子檢測：收集培養第1~8代細胞，分成每EP管（1.5 ml) IX 105細 胞，洗滌后重懸于20 μL的PBS，分別加入小鼠抗人直標PE或FITC單抗CD90、CD44、CD105、 ⑶73,設立陰性對照。流式細胞儀檢測，Cell Quest軟件分析結果。
[0022] 3. miR-26b重組腺病毒表達載體(Ad-26b)的構建 利用帶有Bgin和Xhol酶切位點的rn〇-miR-26b 引物（SEQIDNo·l:5'-CATAGATCTCCCCACATATAACACTG-3 '； SEQ ID No·2: 5 '-GGACTCGAGATAGTGAAGGAGGAAGGG-3'），以大鼠間充質干細胞基因組DNA為模版PCR得到目的基因片段，回收目的基因片段，與 pMD-19-T載體連接后轉化DH5a感受態細胞，挑取單克隆過夜搖培擴增，提取質粒，Bgl Π 和 Xhol雙酶切鑒定，鑒定正確的陽性克隆送上海生工測序鑒定。測序鑒定完全正確的目的基 因片段與腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV利用預設的Bgl Π 和Xhol進行雙酶切定向克隆，產 物轉化ToplO感受態細胞，單克隆過夜搖培擴增，提取質粒，Bgl Π