和XhoI雙酶切鑒定，鑒定 正確的重組穿梭載體命名為pAdTrack-26b。隨后將重組穿梭載體(pAdTrack-26b)與腺病毒 骨架載體pAdEasy-Ι在BJ5183感受態細胞中的同源重組，從而將目的基因連接到腺病毒表 達載體上。先將腺病毒骨架載體pAdEasy-Ι轉化至DNA重組活躍的BJ5183菌株中，在Amp+抗 性下培養及搖培重組菌株，制作感受態細胞。將重組穿梭載體pAdTrack-26b用Pme I限制性 內切酶線性化以暴露其同源重組位點，將酶切產物轉化含pAdEasy-Ι載體的BJ5183感受態 細胞，在Kan+抗性的LB平板上培養，挑取單克隆，搖培、提質粒、瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的 質粒，電泳條帶的帶型、大小與pAdEasy-Ι類似和相近的可能為重組正確的陽性克隆，進一 步將這些質粒用Pac I單酶切鑒定，鑒定完全正確即為表達miR-26b的重組腺病毒，命名為 pAdEasy-26b，將質粒、菌液分別在-80 °C保種。
[0023]將上述構建的重組腺病毒骨架質粒pAdEasy-26b，用Pac I單酶切，取少量電泳檢 測，完全酶切的產物以Lipofectamine 2000按試劑說明書步驟轉染70 %匯合的293A細胞中 包裝。第一輪包裝經7~10 d收獲細胞，反復凍融三次以釋放細胞中的病毒，4°C、5000 rpm離 心5 min，收集上清。將長至70%匯合的293A細胞吸盡培養液，PBS洗2遍，加入上述收集的病 毒上清夜進行第一輪感染，待50%以上的細胞變圓脫落后，收獲細胞，反復凍融三次后收集 病毒上清液，按上述步驟進行下一輪感染。如此經3~5輪感染后可得到高滴度病毒液，接下 來可感染放大培養的293A細胞以擴增病毒，產生更多更高滴度的表達miR-26b的重組腺病 毒，命名為Ad_26b。稀釋法或qPCR法檢測病毒滴度，達到107 pfu/ml即可用于感染宿主細 胞，使宿主細胞高表達miR_26b。
[0024] 4.綠色熒光蛋白（GFP)標記的高表達miR-26b的HUCMSCs細胞 選擇培養至第4代的HUCMSCs，培養匯合度達80%~90%，棄培養基，PBS清洗2遍，加入含約 20 μL Ad-26b病毒液(視病毒滴度而定）的L-DMEM，37°C、飽和濕度5%、C02培養箱感染1.5~2 h，去除病毒液，加入完全培養基，繼續培養24~48 h，熒光顯微鏡下觀察，GFP陽性細胞達70% ~80%以上且細胞狀態良好可用于細胞移植。以感染空病毒Ad的HUCMSCs作為對照細胞。 [0025]圖1為上述高表達miR-26b的人臍帶來源間充質干細胞及miR-26b的表達定量圖； 分離培養的人臍帶來源間充質干細胞HUCMSCs，多次傳代后，經臺盼藍染色測定，各代次細 胞活率均在95%以上;流式細胞儀檢測結果顯示，培養至第3代以后的細胞表達⑶90+、⑶44 +、〇0105+、0)73+，而勵1'-!11^15〇8陰性，符合!11^1^〇8的生物學特征。感染表達111丨1?-2613的重 組腺病毒（Ad-26b) 48 h后，miR-26b的表達量比感染空病毒的對照組顯著上調。
[0026] 5.移植用細胞懸液的準備 (1) HUCMSCs感染高表達miR-26b的病毒載體（Ad-26b)及對照病毒（Ad)，繼續培養 48 h后，得到高表達miR-26b的細胞(Ad-26b -HUCMSCs)及對照細胞(Ad-HUCMSCs)，可用于 細胞移植。移植前，細胞棄原培養基，PBS洗2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液消化，在顯微鏡 下觀察細胞短縮變形后，加入完全培養基終止消化，吹打細胞制成單細胞懸液，1000 r/ min，離心5 min，去除上清液，再用生理鹽水重懸、洗滌、離心2次，將培養液成分去除。加入 生理鹽水重懸細胞，細胞計數，調整細胞密度為2X106/ml，標記為Adieb-HUCMSCs^d-HUCMSCs 細胞懸液， 4-10°C儲存備用， 存儲有效期為12 h。
[0027] 為了進一步提高MSCs靶向肝損傷部位的效率，改善肝功能和組織結構恢復的效 果，Ad-26b-HUCMSCs、Ad-HUCMSCs細胞于移植前換用含10 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor, bFGF)的培養基培養20 h，然后按（1)所述步驟消 化、洗滌、生理鹽水重懸，制成2 X 106/ml的bFGF處理的Ad-26b-HUCMSCs、Ad-HUCMSCs細胞懸 液。
[0028] 6.細胞移植 急性損傷動物模型隨機分為細胞治療組(40只）和模型對照組（10只）。細胞移植治療組 分別尾靜脈一次性給予Ad-26b-HUCMSCs細胞懸液、bFGF處理的Ad-26b-HUCMSCs細胞懸液、 Ad-HUCMSCs細胞懸液、bFGF處理的Ad-HUCMSCs細胞懸液，劑量為1.0X 106/ kg。模型對照組 尾靜脈給予等劑量生理鹽水。正常對照組動物尾靜脈一次性給予等劑量生理鹽水。
[0029] 在移植細胞后的第7 d和14 d分別隨機選擇5只小鼠，乙醚麻醉后摘眼球取血，檢 測△1^^51^1^、了811^、凝血功能等肝功能指標;取血后處死，取肝臟稱重，測算臟器指數;之 后以4%多聚甲醛固定，取部分肝臟冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察切片中綠色熒光陽性細 胞在小鼠肝臟內定植分布情況，見附圖2，其中A:Ad-HUCMSCs注射7 d; B:Ad-HUCMSCs注射14 d; C: Ad-26b-HUCMSCs注射7 d; D: Ad-26b-HUCMSCs注射14 d;統計細胞數量，見附圖 3，與Ad-HUCMSCs組比較，* P<0.05，*# P<0.001。結果顯示，移植后7 d、14 d，在損傷的肝組織中 高表達miR-26b的HUCMSCs數量均顯著高于對照細胞，表明miR-26b能夠促進HUCMSCs歸巢并 定植于損傷的肝組織中。
[0030] 剩余部分肝組織石蠟包埋切片，行HE染色及Masson染色以及白蛋白免疫組織化學 檢測肝臟病理改變。表1為上述高表達miR-26b的人臍帶來源間充質干細胞通過尾靜脈注射 移植到CC14誘導的急性肝損傷小鼠中7d、14d后肝功能轉氨酶指標與肝臟指數。結果顯示， 帶有miR-26b的間充質干細胞移植后谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶均有好轉；治療14 d較治療7 d的各組好轉更為明顯。
[0031] 表1急性肝損傷小鼠尾靜脈注射HUCMSCs細胞懸液7 d、14 d后轉氨酶及肝臟指數
實施例二高表達miR-26b的人臍帶來源間充質干細胞移植到慢性肝損傷小鼠模型 1.慢性肝損傷實驗動物模型的準備 昆明種小鼠，40只，雄性。隨機數字表法分為正常對照組（10只）和模型組(50只）。模型 組均按照3 ml/kg劑量、每周2次（固定時間點于每周一和周五下午14:00)皮下注射CC14與 橄欖油等體積(1:1)混合液，正常對照組皮下注射等劑量橄欖油，方法同實施例一。連續注 射6周后，改為每周注射1次。直到第10周。建模第10周，最后一次造模后24 h，進行移植實 驗。
[0032] 2.移植細胞的準備 Ad-26b-HUCMSCs細胞懸液、bFGF處理的Ad-26b-HUCMSCs細胞懸液的制備同實施例一； 其中堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的濃度為10 ng/ml，處理時間為24 h。
[0033] 3.細胞移植 慢性損傷動物模型隨機分為細胞治療組(40只）和模型對照組（10只）。細胞移植治療組 分別尾靜脈一次性給予Ad-26b-HUCMSCs細胞懸液、bFGF處理的Ad-26b-HUCMSCs細胞懸液、 Ad-HUCMSCs細胞懸液、bFGF處理的Ad-HUCMSCs細胞懸液，劑量為1.0X 106/ kg。模型對照組 尾靜脈一次性給予等劑量生理鹽水。正常對照組動物尾靜脈一次性給予等劑量生理鹽水。 在移植細胞后7 d、14 d分別采血檢測肝功能指標、