臟器指數;肝臟冰凍切片，在熒光顯微鏡 下觀察移植的GFP+細胞在小鼠肝臟內的定植分布情況;肝臟組織石蠟包埋切片，HE染色、 Masson染色檢測肝臟組織的病理改變。
[0034] CC14誘導的慢性肝損傷小鼠經尾靜脈注射Ad-HUCMSCs、Ad-26b-HUCMSCs細胞懸液 7d、14d后，取肝臟組織做冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察移植的GFP+細胞的分布，見附圖4，A: Ad-HUCMSCs注射7 d;B:Ad-HUCMSCs注射 14 d;C:Ad-26b-HUCMSCs注射7 d;D:Ad-26b-HUCMSCs注射14 d。統計細胞數量，見附圖5,與Ad-HUCMSCs組比較，# P<0.01。結果顯示， 移植后7 d、14 d，在損傷的肝組織中高表達miR-26b的HUCMSCs數量均顯著高于對照細胞， 表明miR-26b能夠促進HUCMSCs歸巢并定植于慢性損傷的肝組織中。
[0035] 附圖6為肝臟石蠟切片Masson染色圖，A: Ad-HUCMSCs組；B: Ad-26b-HUCMSCs組；結 果顯示，慢性肝損傷(肝纖維化)小鼠模型移植高表達miR_26b的HUCMSCs 7 d、14 d后，纖維 組織的厚度和范圍比移植對照細胞的各組顯著降低，表明高表達miR-26b的HUCMSCs能夠顯 著減輕慢性損傷肝組織的纖維化程度。 以上結果顯示，與對照組相比，高表達miR-26b的人臍帶來源間充質干細胞移植顯著降 低了肝臟中的纖維組織間隔的寬度，說明高表達miR-26b的間充質干細胞移植對慢性肝損 傷的纖維化具有顯著的修復能力。
[0036] 表2為慢性肝損傷小鼠尾靜脈注射上述HUCMSCs細胞懸液7 d、14 d后肝功能及肝 臟指數，檢測結果顯示，帶有miR-26b的干細胞移植后慢性肝損傷模型小鼠的肝功能指標谷 丙轉氨酶、谷草轉氨酶均有好轉，治療14 d較治療7 d組好轉更為明顯;各移植治療組小鼠 的體重略高于模型對照組。
[0037] 表2慢性肝損傷小鼠尾靜脈注射HUCMSCs細胞懸液7 d、14 d后轉氨酶及肝臟指數
實施例三高表達miR-26b的人臍帶來源間充質干細胞移植到急性肝損傷小鼠模型 1.急性肝損傷實驗動物模型的準備 急性損傷動物模型按實施例一所述方法制備。
[0038] 2.移植細胞的準備 將50 nM miR-26b模擬物與5 μL轉染試劑Lipofectamine 2000分別用250 μL L-DMEM 稀釋，室溫靜置10 min后將二者混合，室溫靜置30 min，得到轉染混合液;將培養至第8代的 HUCMSCs，培養匯合度達80%~90%，棄培養基，PBS清洗2遍，加入轉染混合液和500 μ 1 L-DMEM;然后于37°C培養箱中孵育6 h，接著將轉染混合液更換為完全培養基，繼續培養48 h， 得到高表達miR-26b的細胞（26b-HUCMSCs)，可用于細胞移植。移植前按實施例一所述步驟 制成2X 106/ml的26b-HUCMSCs移植細胞懸液。
[0039]為了進一步提高MSCs靶向肝損傷部位的效率，改善肝功能和組織結構恢復的效 果，26b-HUCMSCs細胞于移植前換用含10 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF)的培養基培養24 h，然后按實施例一所述步驟制成2 X 106/ml 的 bFGF 處理的 26b-HUCMSCs。
[0040] 3.細胞移植 尾靜脈一次性給予26b-HUCMSCs細胞懸液、bFGF處理的26b-HUCMSCs細胞懸液，劑量為 1.0 X 106/ kg。模型對照組尾靜脈一次性給予等劑量生理鹽水。正常對照組動物尾靜脈一 次性給予等劑量生理鹽水。在移植細胞后7 d、14 d分別采血檢測肝功能指標、臟器指數;肝 臟組織石蠟包埋切片，HE染色、Masson染色檢測肝臟組織的病理改變。結果顯示，與模型對 照組相比，高表達miR-26b的HUCMSCs移植后小鼠的肝功能指標谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶均 有好轉，治療14 d較治療7 d組好轉更為明顯。
【主權項】
1. 一種肝損傷靶向間充質干細胞，其特征在于:所述肝損傷靶向間充質干細胞由間充 質干細胞轉染或感染核酸制備得到;所述核酸為miR-26b。2. 根據權利要求1所述肝損傷靶向間充質干細胞，其特征在于:所述肝損傷靶向間充質 干細胞由間充質干細胞轉染或感染核酸后，再經過堿性成纖維細胞生長因子處理得到。3. 根據權利要求1所述肝損傷靶向間充質干細胞，其特征在于:所述間充質干細胞來源 于骨髓、脂肪組織、牙髓、臍帶、臍帶血、羊水或者胎盤。4. 權利要求1所述肝損傷靶向間充質干細胞的制備方法，其特征在于:通過轉染試劑將 miR-26b轉入間充質干細胞得到肝損傷靶向間充質干細胞;或者通過病毒載體將miR-26b轉 入間充質干細胞得到肝損傷靶向間充質干細胞。5. 根據權利要求4所述肝損傷靶向間充質干細胞的制備方法，其特征在于:所述轉染試 劑為脂質體轉染試劑;所述病毒為腺相關病毒、腺病毒、逆轉錄病毒或者慢病毒。6. 根據權利要求4所述肝損傷靶向間充質干細胞的制備方法，其特征在于:通過轉染試 劑將miR-26b轉入間充質干細胞得到肝損傷靶向間充質干細胞的步驟為將miR-26b模擬物 與轉染試劑分別用L-DMEM稀釋后混合，室溫靜置得到轉染混合液;然后將培養至第4~8代、 匯合度達80%~90%的間充質干細胞經PBS洗滌，再加入轉染混合液;然后于37 °C培養箱中孵 育5~6 h，接著把轉染混合液更換為完全培養基，繼續培養36~48 h即可得到肝損傷靶向 間充質干細胞； 通過病毒載體將miR_26b轉入間充質干細胞得到肝損傷靶向間充質干細胞的步驟為將 培養至第4~8代、匯合度達80%~90%的間充質干細胞經PBS洗滌，然后加入表達miR-26b的 病毒上清液，37 °C感染85~95 min后，將病毒上清夜更換為完全培養基繼續培養24~48 h 即可得到肝損傷靶向間充質干細胞。7. 根據權利要求4所述肝損傷靶向間充質干細胞的制備方法，其特征在于:通過轉染試 劑將miR-26b轉入間充質干細胞，然后再經過堿性成纖維細胞生長因子處理得到肝損傷靶 向間充質干細胞;或者通過病毒載體將miR_26b轉入間充質干細胞，然后再經過堿性成纖維 細胞生長因子處理得到肝損傷靶向間充質干細胞。8. 根據權利要求7所述肝損傷靶向間充質干細胞的制備方法，其特征在于:將轉入miR-26b的間充質干細胞置入帶有堿性成纖維細胞生長因子的培養基中，處理0.5~24 h得到肝 損傷靶向間充質干細胞;所述帶有堿性成纖維細胞生長因子的培養基中，堿性成纖維細胞 生長因子的濃度為5~20 ng/mL。9. 權利要求1~3所述任意一種肝損傷靶向間充質干細胞在制備治療肝損傷的靶向藥 物中的應用。10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于:所述肝損傷為病毒感染、寄生蟲感染、乙 醇毒害、藥物毒害、化學毒害或者免疫功能紊亂引起的肝損傷。
【專利摘要】本發明公開了一種肝損傷靶向間充質干細胞及其制備方法與應用，由間充質干細胞轉染或感染核酸制備得到，其高表達miR-26b，具體制備為將人間充質干細胞轉染miR-26b？mimic或感染表達miR-26b的病毒制備得到；為了進一步提高MSCs靶向肝損傷部位的效率，改善肝功能和組織結構恢復的效果，可以利用堿性成纖維細胞生長因子處理間充質干細胞。本發明的肝損傷靶向間充質干細胞對肝損傷有高效的靶向性，有助于減輕肝纖維化、改善肝功能，穩定性高，便于保存和運輸，使用安全，可為肝病患者帶來福音。
【IPC分類】C12N15/86, A61K35/28, A61P1/16, C12N5/10, C12N15/88
【公開號】CN105647872
【申請號】
【發明人】賀麗虹, 張煥相, 許鍵煒
【申請人】蘇州大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月4日